单击此处编辑母版标题样式,编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/9/11,#,血红蛋白的提取和分离,血红蛋白的提取和分离,1,一、关于血红蛋白,血红蛋白是,_,动物红细胞的主要组成成分，负责血液中,_,的运输。,血液由,_,和,_,组成，其中,_,细胞最多。在红细胞的组成中，除水分以外，约,90%,是血红蛋白。血红蛋白由四条肽链组成，包括两条,-,肽链和两条,-,肽链。其中每条肽链环绕一个,_,基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳。血红蛋白因含有,_,而呈现红色。,人和其他脊椎,O,2,和,CO,2,血浆,各种血细胞,红,亚铁血红素,血红素,一、关于血红蛋白人和其他脊椎O2和CO2血浆各种血细胞红亚铁,2,二、关于蛋白质的分离,不同的蛋白质，其分子的,_,、所带电荷的,_,、,_,、吸附性质和对其他分子的,_,等特性存在差异，可利用这些差异来分离不同种类的蛋白质。,1,、凝胶色谱法,凝胶色谱法,也称做分配色谱法，是根据相对,_,分离蛋白质的有效方法。所用的凝胶实际上是一些微小的,_,球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成的，如葡聚糖或琼脂糖。在小球体内部有许多贯穿的通道，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较,_,的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较,_,，移动速度较,_,；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较,_,，移动速度较,_,。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。,形状和大小,性质和多少,溶解度,亲和力,分子质量的大小,多孔,小,长,慢,短,快,二、关于蛋白质的分离形状和大小性质和多少溶解度亲和力分子质量,3,有部分小分子蛋白质没有进入凝胶内，在凝胶外移动，导致分离的蛋白质,_,。若需要得到纯度更高的蛋白质，可用凝胶色谱法进行,_,。,纯度降低,再次分离,有部分小分子蛋白质没有进入凝胶内，在凝胶外移动，导致,4,加入样品,样品的洗脱,1,洗脱,2,洗脱,3,加入样品样品的洗脱1洗脱2洗脱3,5,二、关于蛋白质的分离,2,、电泳,电泳是指,_,。许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的,pH,下，这些基团会带上,_,。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷,_,的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子,_,以及,_,_,_,，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。,_,电泳和,_,电泳是两种常用的电泳方法。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它,_,以及,_,等因素。,带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程,正电或负电,相反,带电性质的差异,分子本身的大小和形状的不同,琼脂糖凝胶,聚丙烯酰胺凝胶,所带净电荷的多少,分子的大小,二、关于蛋白质的分离带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程正电,6,思考,1,、,SDS,聚丙烯酰胺凝胶,电泳可使蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率只取决于它的分子大小，其原理是？,分析：,SDS,的作用：,SDS,能使蛋白质发生完全变性，解聚成,_,；,SDS,能与各种蛋白质（肽链）形成,_,，,SDS,所带负电荷的量,_,蛋白质（多肽）分子所带的电荷，因而可掩盖不同种蛋白质间的,_,，使电泳迁移率完全取决于,_,。,思考,2,、,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳还可以测定蛋白质的分子量，其原理是？,分析：使用,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳测定样品蛋白的分子量时，可选用一组,_,的标准蛋白同时进行电泳，根据标准蛋白的电泳区带位置，经过换算，可以测定样品蛋白质的分子量。,单条肽链,复合物,大大超过,电荷差别,分子的大小,已知分子量,思考1、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可使蛋白质在聚丙烯酰胺,7,思考,2,、,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳还可以,测定蛋白质,的,分子量,，其原理是？,分析：使用,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳测定样品蛋白的分子量时，可选用一组,已知分子量,的标准蛋白同时进行电泳，根据标准蛋白的电泳区带位置，经过一定得换算，可以测定未知蛋白质的分子量。,思考2、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳还可以测定蛋白质的分,8,思考,3,、,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的结果是,_,（整个血红蛋白,/,单条肽链）的分子量。,思考,4,、丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，因此，操作时需要戴上,_,，而且在,_,内进行。,3,、缓冲溶液,在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液,pH,的影响，维持,pH,基本不变。缓冲溶液通常由,1-2,种,_,（例如,H,2,CO,3,/NaHCO,3,、,NaH,2,PO,4,/Na,2,HPO,4,等）溶解于,_,中配制而成。调节,_,就可以制得在不同,pH,范围内使用的缓冲液。,缓冲剂,水,单条肽链,手套和防毒面具,通风橱,缓冲剂的使用比例,思考3、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的结果是_,9,血红蛋白的提取和分离,血红蛋白的提取和分离,10,三、血红蛋白的提取和分离,三、血红蛋白的提取和分离,11,血红蛋白的提取和分离ppt课件,12,三、血红蛋白的提取和分离,得到了含许多杂质的,血红蛋白水溶液,三、血红蛋白的提取和分离得到了含许多杂质的血红蛋白水溶液,13,血红蛋白的提取和分离ppt课件,14,血红蛋白的提取和分离ppt课件,15,三、血红蛋白的提取和分离,得到了含许多杂质的,血红蛋白水溶液,三、血红蛋白的提取和分离得到了含许多杂质的血红蛋白水溶液,16,血红蛋白的提取和分离ppt课件,17,三、血红蛋白的提取和分离,得到了含许多杂质的,血红蛋白水溶液,三、血红蛋白的提取和分离得到了含许多杂质的血红蛋白水溶液,18,1,、干凝胶吸水膨胀。,2,、凝胶色谱柱的装填：将吸水膨胀的凝胶颗粒沿玻璃管内壁灌入，同时轻轻敲击管壁，,排出,柱内,气泡,，并保证柱床上表面平整。静置，使凝胶颗粒沉降至柱内出现清晰固液分界面。,3,、,凝胶珠装填完成之后，需要立即连接,磷酸缓冲液,洗涤平衡凝胶,12h,，使凝胶,装填紧密,。,1、干凝胶吸水膨胀。,19,血红蛋白的提取和分离ppt课件,20,三、血红蛋白的提取和分离,得到了含许多杂质的,血红蛋白水溶液,三、血红蛋白的提取和分离得到了含许多杂质的血红蛋白水溶液,21,样品加入：,滴管尖端紧贴柱内壁，以匀速转圈的方式沿内壁加入样品，保证样品在凝胶上表面均匀分布，形成狭窄、均匀、整齐的圆环状样品层。,洗脱：,以匀速转圈的方式沿内壁加入,磷酸缓冲液,，不能冲乱整齐的环状样品层。,样品加入：滴管尖端紧贴柱内壁，以匀速转圈的方式沿内壁,22,加入样品,样品的洗脱,1,洗脱,2,洗脱,3,加入样品样品的洗脱1洗脱2洗脱3,23,血红蛋白的提取和分离ppt课件,24,三、血红蛋白的提取和分离,得到了含许多杂质的,血红蛋白水溶液,三、血红蛋白的提取和分离得到了含许多杂质的血红蛋白水溶液,25,思考,5,、人们用人的红细胞为材料提取血红蛋白，而不是用鸡的红细胞提取，原因是？,分析：人的红细胞无细胞核，,_,，便于提取血红蛋白。,思考,6,、采血容器中要预先加入柠檬酸钠，目的是,_,。,思考,7,、洗涤红细胞的目的是,_,。,思考,8,、从红细胞中释放血红蛋白时，加甲苯的作用是,_,。,思考,9,、红细胞破裂之后，经高速离心，溶液分为,4,层，从上往下分别是,_,、,_,、,_,、,_,。,思考,10,、如何除掉脂溶性沉淀？,_,。,血红蛋白含量丰富,防止血液凝固,洗去血浆蛋白等杂蛋白,溶解细胞膜,加速红细胞破裂,甲苯层,白色脂溶性沉淀层,红色血红蛋白水溶液层,暗红色杂质沉淀层,过滤,思考5、人们用人的红细胞为材料提取血红蛋白，而不是用鸡的,26,思考,11,、如何除掉甲苯？,_,。,思考,12,、“红细胞的洗涤”时用到,_,（低速,/,高速）离心就能将红细胞与其他物质分开，因为红细胞与其他物质的密度差异,_,。而“分离血红蛋白溶液”时用到,_,（低速,/,高速）离心，因为血红蛋白和其他成分的密度,_,。,思考,13,、对血红蛋白溶液进行粗分离的方法是,_,。具体操作是：取,1mL,的血红蛋白溶液装入,_,中，将透析袋放入盛有,300 mL,的物质的量浓度为,20 mmol/L,的,_,中（,pH,为,7.0),，透析,12h,。,思考,14,、透析袋一般是用,_,（又称玻璃纸）制成的。透析袋能使小分子自由进出，而将大分子血红蛋白保留在袋内。透析可以去除样品中,_,，或用于,_,。,分液漏斗分液,低速,较大,高速,比较接近,透析,透析袋,磷酸缓冲液,硝酸纤维素,分子量较小的杂质,更换样品的缓冲液,思考11、如何除掉甲苯？_。,27,思考,15,、商品凝胶是干燥的颗粒，使用前需直接放在洗脱液中膨胀。为了加速膨胀，可以将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，逐渐升温至接近沸腾，通常只需,1,2h,。这种方法不但节约时间，而且可以除去凝胶中可能带有的,_,，排除胶粒内的,_,。本实验使用的是交联葡聚糖凝胶（,SephadexG-75,）。“,_,”表示凝胶的交联程度,、,膨胀程度及分离范围，,75,表示,_,，即,_,。,思考,16,、凝胶珠装填完成之后，需要立即连接,_,，在约,50 cm,高的操作压下，用,300mL,的物质的量浓度为,20mmol/L,的磷酸缓冲液（,pH,为,7.0),充分洗涤平衡凝胶,12h,，使凝胶,_,。,微生物,空气,G,凝胶得水值,每克凝胶膨胀时吸水,7.5 g,缓冲液洗脱瓶,装填紧密,思考15、商品凝胶是干燥的颗粒，使用前需直接放在洗脱液中,28,思考,17,、凝胶柱内一旦有气泡且无法去除，必需重装，原因是？,分析：,_,。,思考,18,、某实验小组的同学决定重新装填凝胶色谱柱，可能的原因是？,分析：发现凝胶柱内,_,；操作过程中，出现了,_,的现象。,思考,19,、在蛋白质分离过程中，仔细观察,_,色区带在洗脱过程中的移动情况。如果,_,，说明色谱柱制作成功。,思考,20,、请从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀？,分析：如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱,_,，影响分离的效果。,气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果,有气泡且无法去除,洗脱液流干，露出凝胶颗粒,红,红色区带均匀一致地移动,洗脱液的洗脱次序,思考17、凝胶柱内一旦有气泡且无法去除，必需重装，原因是,29,三、血红蛋白的提取和分离,得到了含许多杂质的,血红蛋白水溶液,三、血红蛋白的提取和分离得到了含许多杂质的血红蛋白水溶液,30,蛋白质在,聚丙烯酰胺凝胶,中的迁移率取决于它所带,净电荷的多少,以及,分子的大小,。,思考,1,、,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳,可使蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率只取决于它的分子大小，其原理是？,分析：,SDS,的作用：,SDS,能使蛋白质发生完全变性，解聚成,单条肽链,；,SDS,能与各种蛋白质（肽链）形成,复合物,，,SDS,所带负电荷的量,大大超过,蛋白质（多肽）分子所带的电荷，因而可掩盖不同种蛋白质间的,电荷差别,，使电泳迁移率完全取决于,分子的大小,。,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多,31,思考,2,、,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳还可以,测定蛋白质,的,分子量,，其原理是？,分析：使用,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳测定样品蛋白的分子量时，可选用一组,已知分子量,的标准蛋白同时进行电泳，根据标准蛋白的电泳区带位置，经过一定得换算，可以测定未知蛋白质的分子量。,思考2、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳还可以测定蛋白质的分,32,正在电泳,电泳结果,2.,纯化结果鉴定,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳,正在电泳电泳结果2.纯化结果鉴定SDS聚丙烯酰胺凝胶电,33,血红蛋白的提取和分离ppt课件,34,Marker,纯化前,纯化后,1,纯化后,2,97KD,66KD,45KD,20.1KD,14.4KD,（一组已知分子量的蛋白质）,电泳结果,Marker纯