单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,定量聚合酶链反应测定技术及临床应用,定量,PCR,测定技术之,PCR,概论,PCR,最早的设想：,1971,年,Korana,提出核酸体外扩增的设想,1985,年,Mullis,首先描述的多聚酶链反应（,PCR,，,Polymerase Chain Reaction,）,PCR,的改进与完善：,TaqDNA,多聚酶的应用,1993,年,Kary Mullis,因,PCR,的发明获得诺贝尔化学奖,PCR,技术的基本原理：类似于,DNA,的天然复制过程，,PCR,由变性退火延伸三个基本反应步骤构成,定量,PCR,测定技术之,PCR,概论,定量,PCR,测定技术之,PCR,概论,No.ofNo.Amplicon CyclesCopies of Target,12,24,38,416,532,664,201,048,576,301,073,741,824,7 cycle=128 Amplicon,6 cycle=64 Amplicon,5 cycle=32 Amplicon,4 cycle=16 Amplicon,3 cycle=8 Amplicon,1 cycle=2 Amplicon,2 cycle=4 Amplicon,定量,PCR,测定技术,PCR,概论,PCR,的反应动力学：,DNA,扩增呈,指数上升，,定量,PCR,测定技术,PCR,概论,PCR,扩增的理论模式,每一扩增周期后产物的量可以下式表达：,Yn=Yn-1(1+E)0,E,1,（,1,）,扩增产物的总数量可以下式表示：,Yn=X(1+E)n,（,2,）,定量,PCR,测定技术,PCR,概论,PCR,扩增的实际情况：,已知：扩增周期（,n,）、扩增总产物量（,Yn,）,未知：起始模版数（,Y0,）,变量：扩增效率（,E,）,定量,PCR,测定技术,PCR,概论,影响扩增效率,E,的因素,定量,PCR,的困难,引物,/,靶核酸的退火情况,参与扩增反应试剂的相对量（,Taq,酶,/,靶核酸之比、,扩增仪孔中温度的不均一性、,临床标本中的,Taq,酶抑制物的去除不完全）,定量,PCR,测定技术,PCR,概论,因此在扩增产物的数量与原始模板数量之间没有一个固定的比例关系，通过检测扩增产物很难对原始模板进行准确定量。,定量,PCR,测定技术,PCR,概论,定量,PCR,与定性,PCR,测定的最根本的区别,定量,PCR,测定技术,PCR,概论,平台期,指数期,定量,PCR,测定技术方法,方法：,外标方法,动力学方法,内标共扩增方法,所有的定量,PCR,方法均围绕变量,E,展开,定量,PCR,测定技术方法,定量：,绝对定量（即测定,X,的分子数量）,相对定量（测定不同样本中,X,的,比率）,定量,PCR,测定技术外标方法,即是在扩增检测待测样本的同时，扩增一系列稀释的已知标准（通常为质粒,DNA,），如果在该标准稀释系列发现扩增产物,/,模板成线性相关，则可推导出同时扩增的待测样本中,PCR,模板的相对量。,通过,E,的变化来定量起始模版数,定量,PCR,测定技术外标方法,定量,PCR,测定技术外标方法,广义外标定量,PCR,技术分三种类型：,（,1,）外参法,+,终产物分析,（,2,）外标法,+,过程监测,（,3,）外标法,+,过程监测,+,内对照,定量,PCR,测定技术外标方法,使用外标的定量,PCR,方法的优缺点,优点：（,1,）方法简便，容易建立；（,2,）使用双孔重复测定，这种方法可得到非常准确的结果，甚至可排除管间的差异，但不能排除样本间的差异；,缺点：（,1,）,PCR,反应体系中小的区别也会对测定造成较大的影响。由于最后在扩增效率上的差异，从而使得定量测定精密度和重复性不佳。,因此，如果建立一个使用外标准的,PCR,定量方法，则必须进行方法的精密度（批内变异）和重复性（批间变异）分析，以确定其应用的局限性。,定量,PCR,测定技术实时荧光定量,PCR,实时荧光定量,PCR,原理：,是指在,PCR,反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个,PCR,进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。,定量,PCR,测定技术实时荧光定量,PCR,（,1,）,Ct,：,C,代表,Cycle,，,t,代表,threshold,，即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。,定量,PCR,测定技术实时荧光定量,PCR,（,2,）荧光域值（,threshold,）的设定,threshold=10 SDcycle 6-15,定量,PCR,测定技术实时荧光定量,PCR,（,3,）,Ct,值与起始模板的关系,每个模板的,Ct,值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，,定量,PCR,测定技术实时荧光定量,PCR,（,4,）荧光染料,1,）,TaqMan,荧光探针：,定量,PCR,测定技术实时荧光定量,PCR,2,）,SYBR,荧光染料：,定量,PCR,测定技术实时荧光定量,PCR,3,）,MolecularBeacons Beacons,定量,PCR,测定技术动力学方法,通过确定,PCR,扩增的某一阶段的效率,E,来计算起始模板数。,如果取的样本不连续，则可使用下述将公式（,2,）重排后得到的更为通用的公式，用参数,j,（取样中间隔的周期数）替代,n,，,Yj,（在较高循环周期数取样的产物量）替代,Yn,，,Yi-j,（在较低循环周期数取样的产物量）替代,X,：,E,1,（,Yi/Yi-j,）,1/j (3),定量,PCR,测定技术动力学方法,定量,PCR,测定技术动力学方法,一旦效率确定后，根据公式（,4,）可从测定的产物量和循环周期数计算得到,X,。公式（,4,）来源于公式（,2,）的重新排列：,X,Yn/(1,E)n,（,4,）,定量,PCR,测定技术动力学方法,另一种方式是，根据公式（,2,）的对数形式，以所测定的,Yn,值的对数对函数,n,绘图得到,X,值：,logYn=logX+nlog(1+E)(5),当,n,0,时，可在图上读出,X,值，或通过对公式（,5,）的线性回归计算,X,值（图,2,）。,定量,PCR,测定技术动力学方法,优点,:,1,）不需要外标准；,2,）如果能测定,PCR,产物分子的绝对数量，则可得到待测样本的不同的扩增效率（,Ee,）,定量,PCR,测定技术动力学方法,定量,PCR,测定技术动力学方法,改良方法,:,有限稀释分析,首先将原始模板进行有限稀释，然后对该稀释系列进行,PCR,扩增测定，最低的阳性样本被认为含有与一已知的标准稀释系列中最后的阳性样本中相同量的,PCR,模板,缺点,:,不同批次的,PCR,测定的效率有可能不同,因而测定重复性较差,;,存在高斯（,Gaussian,）（正态）分布,定量,PCR,测定技术内标定量方法,非竞争性内标准的定量,PCR,方法,竞争性内标准的定量,PCR,方法,绕过,E,的问题，通过相对比值来得到起始模版数的相对量,定量,PCR,测定技术内标定量方法,非竞争性内标准：,（,1,）一般为与靶核酸无关的基因组；,（,2,）既可是内源的也可是外源的；,（,3,）与靶核酸无相同的引物结合位点和扩增序列。,定量,PCR,测定技术内标定量方法,非竞争性内标准的优缺点：,优点：内标的制备简单；复管测定可排除管间差异，并且在一定程度上，可排除样本间的差异,缺点：进行,RNA,的定量,PCR,测定极为困难；不能进行绝对定量,定量,PCR,测定技术内标定量方法,竞争性内标准的定量,PCR,方法,“,竞争性,”,内标：人为构建的可与原始靶核酸竞争酶、核苷酸和引物分子的核酸标准。,对内标准的修饰方法包括对野生型基因组的点突变、部份缺失或插入外来顺序等,定量,PCR,测定技术内标定量方法,优点,使用竞争性内标既可进行相对定量也可进行绝对定量。,相对定量具有很好的精密度和重复性。而绝对定量，关键是要证明竞争性内标和野生型靶核酸的扩增效率相同。亦可将竞争性内标置于含已知量的野生型靶核酸的样本中同时扩增来评价。,定量,PCR,测定技术内标定量方法,缺点：,要定量单份的临床样本，必须进行数管竞争性,PCR,测定，每管中靶核酸的量不变，但改变竞争性内标的量，因为只有当待测靶核酸与竞争性内标等摩尔量时才能有可靠的定量。,由于竞争性,PCR,可排除管间和样本间的差异，因此，其可作为准确的,PCR,定量方法，适用于绝对定量及含低拷贝数样本的定量。,定量,PCR,测定技术临床应用,病原体含量测定结果分析（定量）,1.,病原微生物含量与病情之间的关系,2.,新的病原体分子诊断标准,3.,超早期感染治疗用药物及疗法的研究与开发,4.,病原微生物含量与用药之间的关系,5.,新的愈后指标的研究,6,、传染病的发病监控、预测与预防,7,、,mRNA,的表达水平与是否肿瘤及其进展的关系,肿瘤相关基因表达的检测：包括癌基因抗癌基因、肿瘤转移基因及转移抑制基因,肿瘤标志物如癌胚抗原、同功酶、抗体、激素、细胞因子、受体等,8,、等位基因与遗传病之间的关系,等位基因检测,多基因遗传病的突变检测,基因表达异常所致遗传病检测,定量,PCR,测定技术临床应用,应注意的问题：,为什么要做定量测定？,定性和定量测定结果报告上的混淆,定量,PCR,测定技术临床应用,定量,PCR,测定技术临床应用,为什么要做定量测定？,用于已知病毒感染患者抗病毒治疗效果的动态观察及抗病毒药物的临床研究；,用于基因表达方面的研究，如特定的,mRNA,的定量测定。,定量,PCR,测定技术临床应用,定量测定的结果报告：,定量测定测定的是量的,“,多,”,或,“,少,”,；定性测定则是测定某种物质的,“,有,”,或,“,无,”,，用于未知病人的确认诊断。,定量测定结果报告：根据所使用的测定方法的测定范围报告结果，如样本测定结果高出此范围，则可报告,多少，也可对样本稀释后再检测；如低于此范围，则报告,多少，如,103,拷贝数,/ml,，而不能报告为,0,拷贝数,/ml,或阴性。,1.,定量测定重在定量，即如何改善扩增指数期的线性及其范围。,2.,定量测定的准确性较之测定下限要重要得多。,3.,非竞争性内标和竞争性内标对于使用内标的定量测定方法极为关键。合适的非竞争性内标应为在整个细胞周期中均匀表达的基因核酸，而竞争性内标则应尽可能近似原始待测模板。,4.,定量测定应在扩增的指数期进行，因此，更重要的是要使涉及整个扩增过程的每个参数都理想化，以便控制整个扩增，避开扩增“平台期”。,定量,PCR,测定技术临床应用,谢谢大家,!,