单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第六章,沉淀法和吸附法,一、沉淀法,二、,吸附法,(,一,),盐析法,(,二,),有机溶剂沉淀法,(,三,),等电点沉淀法,(,四,),生成盐复合物沉淀法,一、沉淀法,一、沉 淀 法,沉淀是通过,改变条件,或,加入某种试剂,，使溶液,中的溶质由,液相转变为固相,析出的过程。,成本低,设备简单,收率高,浓缩倍数高,操作简单,优点：,盐析法,:,多用于分离纯化各种蛋白质和酶。,有机溶剂沉淀法：,多用于生物小分子、多糖及核酸等,产品的分离纯化，也有用于蛋白质的沉淀。,等电点沉淀法：,用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质,的沉淀。,生成盐复合物沉淀法：,用于多种化合物，特别是小分,子物质的沉淀,。,(,一,),盐析法,高浓度的中性盐能,破坏蛋白质、酶等的胶体性质,，,中和微粒上的电荷,，促使蛋白质等发生沉淀或絮凝现象。,logS,-K,s,S,离子强度为,时的蛋白质的溶解度；,Ks,盐析常数，与温度和,pH,无关；,值,是溶质的特征常数，对于蛋白质而言，其大小主要取决于不同蛋白质的性质，它也与溶液的温度和,pH,值有关，但与盐的种类无关,;,为便于计算，用盐的摩尔数,m,代替离子强度,I,，则,logS,-K,s,m,1,、盐析原理,盐析机理示意图,盐离子与蛋白质分子,争夺水分子,，降低了用于溶解蛋白质的有效水量，减弱了蛋白质的水合程度，破坏了蛋白表面的,水化膜,，导致蛋白质溶解度下降；,盐离子电荷的,中和作用,，使蛋白质溶解度下降；,盐离子引起原本在蛋白质分子周围有序排列的水分子的极化，使,水活度降低,。,碳氧血红蛋白的溶解度与硫酸铵离子强度的关系图,pH6.6,，温度,25,，,logS,0,=17gL,-1,不同蛋白质的溶解度曲线,蛋白质的盐析分布曲线,溶解度曲线,(,a,),和盐析分布曲线,(,b,),蛋白质起始浓度的影响,高浓度蛋白质溶液可以,减少盐的用量，但蛋白,质浓度太高，会发生严,重的共沉作用。,2,、影响盐析的主要因素,无机盐种类的影响,不同盐溶液中碳氧血红蛋白的溶解度与离子强度的关系（,25,）,(),NaCl,;(),KCl,;()MgSO,4,;()NH,4,SO,4,;,()Na,2,SO,4,;()K,2,SO,4,;(),柠檬酸三钠,离子强度越大，蛋白质,的溶解度越低。不同蛋,白质盐析所需离子强度,不同。可用,不同的盐浓,度,将各种蛋白质分别沉,淀析出。,温度的影响,升温，可增加许多无机盐,和小分子有机物的溶解度。,但在高盐浓度中，蛋白质,等生物大分子物质的溶解,度随温度的升高反而减小。,pH,对,的影响,盐析,pH,的选择要以,不降低产物的活性,为原则。由于蛋白质在等电点时最易沉淀，可选择等电点的,pH,作为盐析的,pH,二次盐析,(,二,),等电点沉淀法,是利用,两性电解质在电中性时溶解度最低,的,原理，进行物质分离纯化的方法。,中性盐的浓度增加时，相应于最低溶解度的,pH,值,向偏酸方向移动；同时最低溶解度会有所增大。,等电点沉淀法应在低离子强度下操作。,许多蛋白质的等电点都在,偏酸性,的范围内。,(,二,),等电点沉淀法,是利用,两性电解质在电中性时溶解度最低,的,原理进行物质分离纯化的方法。,中性盐的浓度增加时，相应于最低溶解度的,pH,值,向偏酸方向移动；同时最低溶解度会有所增大。,等电点沉淀法应在低离子强度下操作。,许多蛋白质的等电点都在,偏酸性,的范围内。,许多无机酸的价格低廉，并能为食品标准允许。,缺点：,优点：,酸化时，容易引起,蛋白质失活,，因为蛋白质,对,低,pH,比较敏感。,等电点沉淀实例,从猪胰脏中提取胰蛋白酶原：,胰蛋白酶原的,pI,8.9,，可先于,pH 3.0,左右进行等电点沉淀，除去共存的许多酸性蛋白质,(,pI,=3.0,),。工业生产胰岛素,(,pI,5.3,),时，先调,pH,至,8.0,除去碱性蛋白质，再调,pH,至,3.0,除去酸性蛋白质,(,同时加入一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果,),。,等电点沉淀实例,碱性磷酸酯酶的,pI,沉淀提取：,发酵液调,pH 4.0,后出现含碱性磷酸酯酶的沉淀物，离心收集沉淀物。,用,pH 9.0,的,0.1 mol/L,Tris-HCl,缓冲液重新溶解，加入,20,40%,饱和度的硫酸铵分级，离心收集的沉淀,Tris-HCl,缓冲液再次沉淀，即得较纯的碱性磷酸酯酶,。,(,三,),有机溶剂沉淀法,许多水溶性有机溶剂如丙酮、乙醇、甲醇等,能使溶于水的小分子生物物质以及核酸、多糖、,蛋白质等生物大分子发生沉淀作用。其主要作用,是,降低水溶液的介电常数,。,1,、有机溶剂沉淀的原理,有机溶剂沉淀原理图,分辨能力比盐析法高,一种溶质只在一个比较窄的有机溶剂范围内沉淀,沉淀不需脱盐,有机溶剂密度低，与沉淀物密度差大，,容易进行固液分离,有机溶剂容易蒸发，不会在成品中残留，,因此适用于食品、药品的制备。,优点：,容易引起蛋白质变性失活,有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高,需冷却、降温、低温操作。,缺点：,对同一种溶剂，蛋白质的分子质量越大，,沉淀所需有机溶剂的量越少,。,2,、影响有机溶剂沉淀的因素,有机溶剂的种类：,选择的溶剂必须能与水互溶，但与产物如蛋白质等,不发生反应。,温度：,降低温度可以增加收率。,同时许多生物分子如蛋白质、核酸等对温度特别敏感，温度稍有升高，便发生变性。,pH,：,选择溶解度最低时的,pH,，,有助于提高沉淀效果。,因此在接近等电点处，以引起沉淀所需有机溶剂的量较少。合适的,pH,也可大大提高分离的分辨能力。,样品浓度和分子质量：,低浓度样品需用有机溶剂的量较大，但共沉作用小，有利于提高分离的效果；但低浓度样品损失较大，回收率低，具有生理活性的样品容易产生稀释变性。,金属离子和离子强度：,Mn,2+,、,Fe,2+,、,Co,2+,、,Zn,2+,等阳离子能与蛋白质中的羧基、氨基和含有氮杂环的化合物结合，形成难溶复合物，有利于沉淀。,但离子强度过大，不利分离,。,3,、有机溶剂沉淀实例,（四）生成盐复合物沉淀,柠檬酸钙盐沉淀,1,、提取过程的化学反应：,2C,6,H,8,O,7,H,2,O+3CaCO,3,Ca,3,(C,6,H,5,O,7,),2,4H,2,O+3CO,2,+H,2,O,Ca,3,(C,6,H,5,O,7,),2,4H,2,O+3H2SO4+4H,2,O,2C,6,H,8,O,7,H,2,O+3CaSO,4,2H,2,O,1,、工艺流程：,3、中和与酸解,中和：,滤液中除含柠檬酸外，还含可溶性的残,糖以及蛋白质、金属离子等杂质。利用,柠檬酸钙难溶于水的特点，与杂质分离,的过程。,酸解：,中和所得钙盐经过滤、洗涤，与硫酸反,应生成柠檬酸和硫酸钙沉淀，过滤，滤,液含较纯的柠檬酸。,4,、生产设备及操作,调浆：,调浆罐，,3050%,浓度；,中和：,中和罐，滤液、钙浆泵入，搅拌，,70-90,，控制 终点；,过滤：,过滤槽、带式过滤机，,90,热水逆流洗涤；,酸解：,酸解罐，搅拌，稀酸调浆，加热，加硫酸，,控制终点；,过滤：,过滤槽、带式过滤机，,90,热水逆流洗涤，,至,pH,大于,4,。,(,一,),吸附过程的基础理论,(,二,),吸附类型,(,三,),影响吸附过程的因素,二、吸附法,选择性吸附法用于：分离精制各种产品、空气的,净化、除菌、脱色、除热源、去组胺等杂质。,吸附作用：,物质从流体相,(,气体或液体,),浓缩到固体表面,的过程。,吸附剂：,在表面上能够发生吸附作用的固体。,吸附物：,被吸附的物质。,(,一,),吸附过程的基础理论,不同固体物质的表面自由能不同，所以对其他物质,的吸附能力不同，表面自由能越高，吸附能力越强。,吸附作用力,也是范德华力。它是一组分子引力,的总称，包括三种力，即定向力、诱导力和色散力。,定向力：,是极性分子之间产生的作用力，是极性分子间,的静电引力，分子的极性越大，力也越大。,诱导力：,指极性分子和非极性分子之间的吸引力，极性,分子产生的电场作用会诱导非极性分子极化，,两者之间相互吸引而发生吸附作用。这种力与,温度无关。,色散力：,是非极性分子之间的引力，当分子外围电子运动,及原子核在零点附近震动，正负电荷中心出现瞬,时相对位移时，产生快速变化的,瞬时偶极矩,，能,使外围,非极性分子极化,，反过来又影响瞬时偶极,矩的变化而产生这种色散力。与温度无关。,此外，还有,氢键力,，这是介于库仑引力和范德华力之间的定向力，比诱导力和色散力都大。,(,二,),吸附类型,1,、物理吸附：,吸附剂和吸附物通过,分子间的引力,产生的吸附。,特点：,吸附作用不仅局限于活性中心，而是整个自由界面；,分子被吸附后，一般动能降低，所以吸附是放热反应；,物理吸附的吸附热较小，吸附物分子的状态变化不大，所需活化能很小，多数在较低的温度下进行；,物理吸附是可逆的，吸附作用一般没有选择性。,2,、化学吸附,吸附剂与吸附物之间由于,电子转移发生化学反应,产生的吸附。,特点：,需要一定的,活化能,；,具有显著的,选择性,，一种吸附剂只对特定的物质有吸附作用；,吸附,速度较慢,，升高温度速度增加；,吸附后也较,稳定,，不易解吸，且解吸具有选择性,；,吸附热较大,。,物理吸附与化学吸附虽有区别，但有时很难,严格划分，也可以在同一体系中向时发生。,（三）影响吸附的因素,溶液中，固体吸附剂的吸附要考虑三种作用力：,界面层上固体与溶质之间的作用力；,固体与溶剂之间的作用力；,溶质与溶液之间的作用力。,吸附剂的性质：,容量大、速度快、机械强度高,吸附物的性质：,极性宜从非极性中吸附极性物,溶液,pH,的影响：,非极性宜从酸性中吸附有机酸,温度的影响：,吸附热越大，受温度影响越大,溶液中其他溶质的影响：,一般使吸附量下降,影响吸附的因素：,作 业,1,、何谓盐析？其原理是什么？,2,、影响盐析的主要因素有哪些？,3,、有机溶剂沉析法的原理是什么影响有机溶剂沉析的主要因素有哪些？,有机溶剂沉淀的机理,4,、,吸附的类型有哪些？其各自机理分别是什么？,