单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,重组蛋白药物包涵体表达、复性和分离纯化,姓名：何云凤,时间：,20160827,2,发酵液,细胞分离,胞内产物,胞外产物,细胞破碎,固液分离,包涵体,细胞碎片分离,变性,复性,浓缩 初步分离 高度纯化 制剂,产品,基因工程制品分离纯化的一般流程,包含体的形成和性质,在,大肠杆菌,中表达的基因工程蛋白常常以,包涵体,的形式沉积于细胞内，表现为,无活性的不溶性聚集物,包涵体：,外源目的基因在宿主系统中高水平表达时，因,各种原因,导致基因表达产物的,一级结构（即氨基酸序列）虽然正确，而其高级结构是错误的,，即：没有生物活性的包涵体。包涵体直径约,0.5-1m,，具有,很高的密度,（约,1.3 mg/ml,），相差显微镜下有,折光性,，呈,非水溶性,，,只溶于高浓度变性剂如尿素、盐酸胍,等。,包涵体形成的几种可能性,研究发现：,低表达时很少形成包涵体,，表达量越高越易形成包涵体。,1,）,少量蛋白产生时是可溶的，,表达量过高,，积聚量超过其在细胞内溶解度时沉淀；,2,）,合成速度太快，以至于,没有足够的时间,进行折叠，二硫键不能正确配对；,3,）,重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。,4,）重组蛋白的氨基酸组成，,一般说来含硫氨基酸越多、,Pro,含量越高越容易形成包涵体。,5,）重组蛋白所处的环境：,发酵温度高时容易形成包涵体。,包涵体形成：,Advantages,1,、细菌的生长快速利于大规模生产。包涵体形式表达的蛋白质浓度比较高，,有时甚至可以达到细胞总蛋白含量的,40%,2,、,重组蛋白质以包涵体形式存在,包埋了酶攻击的位点，可以最大限度地,抵抗蛋白质酶的攻击,3,、分离,比可溶蛋白质的分离方法,简便,，造价低,，使用简单的离心或者过滤的手段就能使包涵体与宿主细胞的其他蛋白质成分进行有效的分离,4,、,有些表达的外源蛋白质,对细胞有毒性或者致死，,大量表达时会导致细胞的死亡，最终的细胞数量和产物相当低；而,包涵体形式的蛋白质因丧失了生物活性,高效地表达,包涵体加工流程,离 心,去除细胞碎片,（膜蛋白和脂类等）,机械破碎法,包涵体提取,如何对包涵体蛋白进行,高效体外复性,以获得活性产品,是生物工程产业化的一个难题,细胞破碎就是,采用物理、化学、酶或机械的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产物最大程度地释放到液相中。,细胞破碎,分 类,作用机理,适应性,物理破碎,高压匀浆法,液体剪切作用,可达较高破碎率，,可大规模操作,，不适合丝状菌和革兰氏阳性菌,珠磨法,固体剪切作用,可达较高破碎率，,可较大规模操作,，大分子目的产物易失活，浆液分离困难,超声破碎法,液体剪切作用,对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作,渗透压法,渗透压剧烈改变,破碎率较低，常与其他方法结合使用,反复冻融法,反复冻结,-,融化,破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物,干燥法,改变细胞膜的渗透性,条件变化剧烈，易引起大分子物质失活,X-press,法,固体剪切作用,破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目的产物不适合,化学破碎,酶溶法,酶分解作用,具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，溶酶价格高，通用性差,化学渗透法,改变细胞膜渗透性,具一定选择性，浆液易分离，但释放率较低，通用性差,常用破碎方法,（按细胞所受作用）,包涵体的洗涤,细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。,洗涤的重要性：,收集的沉淀中，除包涵体外，还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分子而聚集，给后步纯化带来困难。,洗涤剂：,温和的表面活性剂（,Triton X-100,）、低浓度的弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂质类杂质。,洗涤剂浓度,以,溶解杂质，不溶解包涵体中表达产物,为原则。,包涵体的溶解,二硫键,目,的,次级键,变性剂,去污剂,还原剂,盐酸胍、尿素,SDS,、,Triton 100,巯基乙醇、,DTT,蛋白质的复性,：,包含体蛋白质,溶解于,变性剂溶液中，呈变性状态，所有的氢键、疏水键全部被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键不被破坏，当除去变性剂后，一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一,折叠过程,称为,蛋白质复性,。,如何使包涵体的构型复原成正确状态？,复性常用方法,稀释,透析,超滤,复性法,折叠促进剂协助复性法：,表面活性剂、,PEG,、,分子伴侣,等,反相胶团复性法、双水相体系复性法,层析折叠复性（固相复性）：,凝胶过滤层析（,GF,）、亲和层析（,AFC,）、离子交换层析（,IEC,）、疏水层析（,HIC,）等,复性,复性的成功秘诀在于,促进主要途径抑制导致聚集体形成的竞争性途径,，通常需要仔细优化大量参数：蛋白浓度、温度、时间、pH,、缓冲添加剂等等,色谱过程及其分类,色谱法是利用混合物中各组分,物理化学,性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为,固定相,；另一相流过固定相，称为,流动相,）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的,。,层析填料的选择,凝胶过滤色谱,凝胶过滤色谱(Gel Filtration Chromatography GFC)又称为分子排阻色谱(Size Exclusion Chromatography SEC），,凝胶色谱主要用于脱盐、分级分离及分子量的测定。,生物体内许多大分子化合物具有与其结构相对应的专一分子可逆结合的特性,(,亲和力,),。把与目的产物具有,特异亲和力,的生物分子固定化后作为固定相，则当含有目的产物的混合物(流动相)流经此固定相时，即可把目的产物从混合物中分离出来,。,亲和色谱,(,Affinity Chromatography，AFC),亲和色谱,(,Affinity Chromatography，AFC),离子交换色谱是基于,离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换,，由于混合物中不同溶质对交换剂具有不同的结合力而将其分离。,该法适合于离子和在溶剂中发生电离物质的分离。离子交换色谱广泛用于生物大分子分离纯化，特别是在蛋白质、多肽、核酸等生物物质的分离纯化。,离子交换色谱(,Ion Exchange Chromatography，IEC),离子交换色谱(,Ion Exchange Chromatography，IEC),疏水色谱（,HIC）,疏水相互作用色谱（Hydrophobic Interaction Chromatography HIC）原理是在高浓度的盐溶液中，蛋白质会被吸附到疏水色谱填料的疏水基团上，当逐渐降低盐浓度时，它们会,按疏水性的强弱先后被洗脱,。,疏水色谱（,HIC）,推荐书籍、资料,1.,Insoluble Proteins Methods and Protocols,2.GE,重组蛋白纯化手册,Thank You!,