单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,禽病学(完整版)禽病学实验指导课件,1,禽病学(完整版)禽病学实验指导课件,2,实验一 新城疫血凝与血凝抑制试验,目的意义：,掌握血凝试验（HA）与血凝抑制试验（HAI）,的基本方法；,体会HA与HAI在新城疫病毒及其它病毒诊断和鉴定中的应用。,基本原理：,许多病毒表面具血凝素，具有凝集某些动物或人红细胞的特性，称为血凝现象，可用于鉴定病毒。血凝现象可以被特异性抗体所抑制，称为血凝抑制现象，利用这种特性可进行血清学试验，称为血凝抑制试验。,实验一 新城疫血凝与血凝抑制试验目的意义：,3,器材及试剂:,待检病毒:鸡新城疫病毒鸡胚尿囊液；,待检血清：抗鸡新城疫病病毒阳性血清；,生理盐水、1%鸡红细胞、96孔V形微量血凝板、加样器等。,器材及试剂:,4,（一）血凝试验（HA）：,取96孔板，按以下步,骤操作：,1、第一排1-12孔各加生理盐水50ul，第二排1-12,孔加生理盐水50ul为红细胞对照；,2、吸50ul病毒液于第一排第1孔，混匀后取50ul,至第2孔，依次稀释至第12孔，弃去50ul，各,孔经倍比稀释后稀释度依次为2,-1,2,-12,。,实验步骤,（一）血凝试验（HA）：取96孔板，按以下步实验步骤,5,3、第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%鸡红细,胞50ul，微型震荡器震荡2min混匀。,4、室温静置10-30分，观察结果。,5、结果判定：红细胞对照组红细胞完全沉降，以试验排中能使等量红细胞发生完全凝集的病毒最高稀释倍数，作为病毒的血凝价，即HI效价，用2,n,表示。,3、第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%鸡红细,6,血凝试验流程图,血凝试验流程图,7,（二）血凝抑制试验（HAI）,：取一96孔板，按以下步骤操作：,1、4个单位抗原的制备：按HA试验测出的病毒血凝价除以4即为4个单位血凝素的稀释度。,2、待检血清的稀释：第一、二、三排1-12孔各加生理盐水50ul，于第一排第1孔中加入50ul待检血清，反复吹吸3-5次混匀后，取50ul至第2孔混匀，吸取50ul至第3孔，依次稀释至第12孔，弃去50ul，经倍比稀释，血清的稀释倍数为2,1,2,12,。,（二）血凝抑制试验（HAI）：取一96孔板，按以下步骤操作：,8,3、第一、二排1-12孔各加4个单位血凝素50ul，微量震荡器震荡2min混匀；,4、室温静置20min；,5、第一、二、三排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul，微量震荡器震荡2min混匀混匀。,6、室温静置10-30分，观察结果；,3、第一、二排1-12孔各加4个单位血凝素50ul，微量震荡,9,7、结果判定：第二排为抗原对照，红细胞应全部凝集，第三排为红细胞对照，红细胞应全部沉降。以待检血清能完全抑制病毒凝集红细胞的最高稀释倍数为血清的HAI效价，用2,n,表示。,7、结果判定：第二排为抗原对照，红细胞应全部凝集，第三排为红,10,血凝抑制试验流程,血凝抑制试验流程,11,实验二 病毒的鸡胚培养,目的意义：,了解禽源病毒鸡胚培养的意义及用途,掌握病毒鸡胚培养的基本方法,基本原理：,鸡胚培养是培养某些病毒常用方法,此方法可用于某些病毒的分离、增殖、毒力滴定、中和试验及生产疫苗等。病毒接种鸡胚的途径有多种，主要有卵黄囊接种、绒毛尿囊腔接种、绒毛尿囊膜接种、羊膜腔接种途径等，应根据需要选择适当的途径。,实验二 病毒的鸡胚培养目的意义：,12,卵黄囊,胚体,羊膜囊,绒毛尿囊腔,气室,鸡胚结构模式图,卵黄囊胚体羊膜囊绒毛尿囊腔气室鸡胚结构模式图,13,器材及试剂:,病毒：鸡新城疫病毒弱毒疫苗；,鸡胚：9-11日龄白壳受精卵；,孵卵箱、检卵灯、钢针、注射器、2.5%碘酒、,75%乙醇、固体石蜡、眼科剪、眼科镊等。,器材及试剂:,14,实验步骤:,1.准备鸡胚：接种前用检卵灯观察是否为受精卵,及其活力。,2 接种（绒毛尿囊腔途经）：,（1）在检卵灯下，用铅笔勾出气室及胚胎的,位置，并在尿囊膜血管较少的地方作记号。,（2）消毒：用碘酒消毒气室蛋壳，酒精脱碘，,用灭菌钢针在记号处打一孔。,实验步骤:,15,（3）接种病毒：用18mm针头的1ml注射器吸,取鸡新城疫病毒，针头通过打出的孔进针，刺入尿囊腔，注入0.1ml。,（4）用融化的石蜡封闭小孔，39,孵化器中,孵化72h。,（3）接种病毒：用18mm针头的1ml注射器吸,16,3 收获：,接种后每4小时照蛋一次，弃去24h内死亡胚。,（1）鸡胚放入普通冰箱内冷藏12h，使胎血凝固。,（2）分别用碘酒和酒精消毒卵壳，用灭菌剪刀除去气室卵壳及壳膜，撕开下面的尿囊膜。,（3）将鸡胚稍倾向一侧，用灭菌吸管吸出尿囊液待检。,（4）观察鸡胚的发育及是否有无病变。,3 收获：,17,实验三 鸡白痢平板凝集试验,目的意义：,了解平板凝集试验在鸡白痢诊断及监测中的应用,学习鸡白痢平板凝集试验的操作方法。,基本原理：,细菌等颗粒性抗原与特异性抗体结合后，在有电解质的情况下，会出现肉眼可见的凝集块，称为凝集反应。直接凝集反应可分为玻片凝集与试管凝集。凝集试验是疾病诊断及体内抗体水平测定的常用方法。,实验三 鸡白痢平板凝集试验目的意义：,18,禽病学(完整版)禽病学实验指导课件,19,器材及试剂:,抗原,和血清：,鸡白痢凝集抗原、鸡白痢标准阳性血清、阴,血清、待检血清,生理盐水、玻片、加液枪（20-200ul）、接种环等。,实验步骤:,1.取一洁净玻片，用蜡笔划成方可格，编号,2.各方格分别加被检血清0.08、0.04、0.02、0.01ml。,3.将凝集抗原摇匀，重直滴一滴于各格血清上。,4.用火柴棒混匀，摊开直径1cm左右。,器材及试剂:,20,5.静置3-4分，再拿起玻板轻轻转动，按下列标准记反应结果：,+：出现大片凝集，液体完全透明，即100%凝集,+：有明显凝集片和颗粒，液体几乎完全透明，即75%凝集,+：有可见的凝集片和颗粒，液体不甚透明，即50%凝集,+：仅仅可以看见颗粒，液体混浊，即25%凝集,-：液体均匀混浊，无凝集现象,（同时应设阳性、阴性血清及抗原对照）,6.结果判定：,5.静置3-4分，再拿起玻板轻轻转动，按下列标准记反应结,21,实验四 鸡传染性法氏囊病琼脂扩散试验,目的意义：,掌握琼脂免疫扩散试验的操作技术,体会其在鸡传染性法氏囊病诊断及监测中的意义,基本原理：,鸡传染性法氏囊病病毒抗原与相应抗体在适当电解质存在下结合，在半固体琼脂中扩散,经过一定时间形成肉眼可见的沉淀物，据此判断是否存在相应的抗原或抗体，作为诊断鸡传染性法氏囊病的依据之一。,实验四 鸡传染性法氏囊病琼脂扩散试验 目的意义：,22,器材及试剂:,生理盐水、琼脂糖、硫柳汞、平皿、打孔器、移液器、吸头 等。,实验步骤:,1、制板:加融化的1%琼脂于洁净玻片或培养皿内，厚2.5-3.0mm。,2、打孔：待琼脂凝固后打孔，多为梅花形，一般孔径3-4mm，孔距4-5mm。,3、加样：于中央孔加入标准沉淀抗原，周围1、4孔内加阳性血清对照，2、3、5、6孔为待检血清。,器材及试剂:,23,4、加样完后，将琼脂板置于湿盒中，37,扩散,24-48h。,5、结果判定：若待检血清与抗原孔之间出现白色沉淀线，则表示阳性，若不出现沉淀线，为阴性。,若用于检测血清效价，则以出现沉淀线的血清最高稀释倍数表示（2,n,）。,用于两种抗原比较时，沉淀线有多种情形，应具体分析。,4、加样完后，将琼脂板置于湿盒中，37 扩散24-48h。,24,禽病学(完整版)禽病学实验指导课件,25,制板,打孔,封底,加样,置湿盒中,扩散,琼脂扩散试验流程图,制板打孔封底加样置湿盒中扩散琼脂扩散试验流程图,26,实验五 禽霍乱的诊断,目的意义：,认识禽霍乱病原巴氏杆菌两极染色的特性,熟悉禽霍乱的诊断方法和步骤,认识病原菌分离鉴定在禽病诊断中的作用,基本原理：,禽巴氏杆菌病又称为禽霍乱，主要表现为败血症，即实质器官的出血、肿大与坏死。巴氏杆菌在病禽组织内呈典型的两极着色，纯培养物呈卵圆形或短杆状；在血或血清琼脂上生长良好，呈露珠样小菌落并有不同颜色的荧光；能发酵多种糖；多杀性巴氏杆菌能致死小白鼠、家兔等。故常依据形态特征、培养特性、生化特性和动物实验等来鉴定。,实验五 禽霍乱的诊断目的意义：,27,器材及试剂:,病料：患病鸭组织（肝、脾、肺）或体液,（血、胸腹腔渗出液）；,培养基：5-10%兔血琼脂平板；,动物：小白鼠或成年健康家兔；,无菌生理盐水、吸管、注射器、针头、酒精,灯等。,器材及试剂:,28,实验步骤:,（一）形态学检查：病料或心血涂片，瑞氏染色。,（二）培养特性检查：将病料接种于血琼脂平板 37,培养24h。,（三）生化鉴定：,实验步骤:,29,鸭 霍 乱 心 血 涂 片中的多杀性巴氏杆菌,鸭 霍 乱 心 血 涂 片中的多杀性巴氏杆菌,30,（四）动物回归实验：将病料剪碎并研磨，用灭菌生理盐水制成1:10悬液，也可将血琼脂平板培养物制成悬液，皮下注射小白鼠，0.1-0.3ml/只。注意观察小鼠的表现，待发病死亡后，即行解剖，观察小鼠病变，用肝、脾触片或心血涂片，瑞氏染色镜检，,应有两极浓染的球杆菌,。同时上述病料接种血琼脂平板，次日观察细菌生长情况和菌落特征。,（四）动物回归实验：将病料剪碎并研磨，用灭菌生理盐水制成1:,31,临床症状,病理变化,触片染色镜检,培养特性,生化特性,血清学试验,初步诊断,动物回归试验,确诊,流行病学调查,临床症状病理变化触片染色镜检培养特性生化特性血清学试验初步诊,32,