Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,酶联免疫吸附实验(shyn),第一页，共44页。,掌握酶联免疫吸附实验(shyn)（ELISA）的原理,熟悉酶联免疫吸附实验(shyn)的操作方法,了解其他免疫标记技术,一、实验(shyn)目的,第二页，共44页。,二、实验(shyn)原理,免疫学分析方法发展很快，特别是在使用标记了的抗原和抗体的分析技术以后，使原来许多经典的分析方法在敏感性和特异性方面都不能相比。继50年代(nindi)的免疫荧光（IF）和60年代(nindi)的放射免疫(RIA)分析技术之后，在70年代(nindi)初期又建立了用酶来标记抗原或抗体的分析技术（酶免疫技术）。,第三页，共44页。,是指用荧光素、放射性同位素、酶、发光(f un)剂或电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。,特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位,分类：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光(f un)免疫测定。,免疫(miny)标记技术（immunolabelling technique）,第四页，共44页。,免疫(miny)标记技术=,抗原抗体反应,示踪物标记,灵敏性,特异性,免疫标记技术的主要特点：,高度特异性,、,高度灵敏性,免疫(miny)技术+标记技术,酶,荧光(ynggung)素,同位素,第五页，共44页。,免疫标记技术,放射物标记技术,酶标记技术,免疫荧光技术,其他标记技术,酶联免疫吸附技术,酶免疫组化技术,第六页，共44页。,是将抗原(kngyun)和抗体的特异性免疫反应与酶的催化反应相结合而建立的一种免疫检测技术。,就是利用酶标记抗体或抗原(kngyun)，以检测相应抗原(kngyun)或抗体的一种免疫学标记技术。,Ag+AbE AgAbE,+底物,呈色反应,酶免疫(miny)技术(enzyme immunoassay),第七页，共44页。,是一类常用的酶免疫技术。是将已知的抗原或抗体吸附(xf)在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。,ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定。,ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。,本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。,酶联免疫吸附试验(shyn)ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）,第八页，共44页。,ELISA的基本原理有三条：,（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；,（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；,（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定(pndng)是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。,第九页，共44页。,ELISA过程包括：抗原吸附在固相载体上，这个过程称为包被，加待测抗体,再加相应酶标记抗体，生成抗原-待测抗体-酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算(j sun)抗体的量。待测抗体的量与有色产物成正比。同理也可包被抗体，测定抗原含量。,由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。,第十页，共44页。,常用(chn yn)酶及其底物,1.辣根过氧化物酶(HRP),常用底物：,(1)邻苯二胺(OPD)：反应显橙黄色，应避光，致癌性。,(2)四甲基联苯胺(TMB)：反应后呈蓝色，无需(wx)避光，无致癌性,但水溶性差。酶反应用HCL或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，最适吸收波长为 450nm。,2.碱性磷酸酶(AP),常用底物 对硝基苯磷酸酯(p-NPP)：产物为黄色。,AP灵敏性高与HRP，但不易获得纯品，稳定性较HRP差，且价高，故应用(yngyng)不如HRP普及。,peroxidase(POD),第十一页，共44页。,Colorimetric ELISA Substrates,第十二页，共44页。,ELISA常用的几种方法,(一)测定抗原(kngyun)的，主要有四种方法,1.竞争法,2.双抗体夹心法,3.改良的双抗体夹心法,4.抑制性测定法。,第十三页，共44页。,第十四页，共44页。,第十五页，共44页。,第十六页，共44页。,第十七页，共44页。,(二)测定(cdng)抗体方面：所用的方法称为间接法，也 是目前最常用的方法.,第十八页，共44页。,HBV感染(gnrn)后的血清学指标:,HBsAg,HBsAb,HBeAg,HBeAb,HBcAb(IgG,IgM),乙肝表面抗原，存在(cnzi)于HBV感染者的血清中,为感染指标之一。,三、实验(shyn)步骤,乙肝病毒存在三对抗原抗体系统,1.,即表面抗原（,HbsAg,）和表面抗体（抗,-HBs,）、抗原（,HBeAg,）和,e,抗体（抗,-HBe,）、,3.,核心抗原（,HBcAg,）和核心抗体（抗,-HBc,）,因核心抗原主要存在于肝细胞中，血清中不能表达，检测困难，故只能检测二对半而不能检测三对，所以称为二对半。,第十九页，共44页。,掌握酶联免疫吸附实验(shyn)（ELISA）的原理,辣根过氧化物酶(HRP),酶免疫试验（EIA）结合光学显微镜或电子显微镜可进行抗原定位与结构的研究，用酶标记抗原或抗体结合免疫扩散及免疫电泳可提高试验的敏感性。,（十）对使用仪器(yq)要求,（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；,谢谢(xi xie)观看,酶免疫试验（EIA）结合光学显微镜或电子显微镜可进行抗原定位与结构的研究，用酶标记抗原或抗体结合免疫扩散及免疫电泳可提高试验的敏感性。,二、实验(shyn)原理,2、阴性对照孔OD(optical density)均值大于时重新实验，小于时以计算。,(一)测定抗原(kngyun)的，主要有四种方法,但每批微量反应板对抗原(kngyun)或抗体蛋白质的吸附性能是有显著差别的。,（1）底物在未被酶催化以前应该是无色的，而经 酶催化后有明显的颜色变化，这样(zhyng)可使结果分辨清楚；,第三十一页，共44页。,0时终止反应，记录这个时间，如30分钟，以后用本批酶结合物测定待检样品时都采用同一时间终止反应，这个办法不需要校正，比较方便。,1、编号：微孔条按顺序编号。,实验(shyn)材料,诊断(zhndun)试剂盒,抗原(kngyun)（阳性对照），阴性血清，待检血清,第二十页，共44页。,微孔条已经包被HBsAb,1、编号：微孔条按顺序编号。,2、加样：分别加入待检血清、阳性血清、阴性血清各50ul，空白对照。,3、加入酶结合物：每孔中加入酶结合物50ul，空白对照孔不加，轻拍混匀。,4、温育：贴上胶纸，37温育30分钟。,5、洗涤：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完往后扣干（每次保持30-60秒的浸泡时间）。,6、显色：每孔加底物A、B各50ul，轻拍混匀，封口(fng ku)，37暗置10-15分钟。,7、终止：每孔加终止液50ul，轻拍混匀。,8、测定：用酶标仪单波长450nm测定各孔OD值，并记录结果，读数在加终止液10分钟内完成。,第二十一页，共44页。,结果(ji gu)判定：,1、临界值（CO，cutoff）的计算：临界值=阴性对照孔OD均值。,2、阴性对照孔OD(optical density)均值大于时重新实验，小于时以计算。,结果(ji gu)判定：样品OD值S/CO1者为阳性，,样品OD值S/CO1者为阴性。,第二十二页，共44页。,四、注意事项,1、所有样品按传染源处理；,2、加试剂前应混匀，力求滴加准确；,3、加样应加在板孔的底部，避免产生气泡并迅速完成；,4、洗涤时各孔均需加满，洗涤必须(bx)彻底，防止产生假阳性；,5.温育的时间要严格控制。,第二十三页，共44页。,五、ELISA的影响(yngxing)因素,（一）固相载体,（二）抗原,（三）试验样品,（四）结合物,(五）洗涤剂与稀释剂,（六）底物,（七）作用时间,（八）结果判断,(九)试验的重复性（精确度）,（十）对使用仪器(yq)要求,自习(zx),第二十四页，共44页。,（一）固相载体(zit),在ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板及塑料管。但每批微量反应板对抗原(kngyun)或抗体蛋白质的吸附性能是有显著差别的。实验证明，吸附效果似乎与塑料的类型及其表面性质有关。特别是塑料制品在加工过程中因工艺不同或受其他因素的影响而造成吸附性能的极大差异，甚至完全丧失吸附能力。因此，对每批制品在使用前，必须经过实验室鉴定。,第二十五页，共44页。,（二）抗原(kngyun),包被所用的抗原必须是可溶性的，而且要求是优质和稳定的制剂，纯度和免疫原性要高。如果不纯，由于抗原中所含杂质就会竞争固相载体(zit)上的有限位置，降低敏感性和特异性。此外还应考虑到制备包被抗原不应破坏其免疫学活性。,对大多数传染病和寄生虫病的血清学诊断中所用的抗原并非要求十分严格，一般能用于补体结合试验的可溶性抗原均可用于ELISA。,对某些抗原必须进行提纯，如病毒的组织培养和鸡胚培养物以及病毒接种动物的脏器等，它们当中存在着许多非抗原的蛋白质，必须设法除去，常用梯度超速离心或亲和层析法提纯，不经提纯是不能使用的。,第二十六页，共44页。,（三）试验(shyn)样品,血清、血浆(xujing)或其他体液，均可作为ELISA的试验样品（标本）。但应注意分离血清时，血液要求放置室温中凝固收缩，不宜置冰箱（4）中凝固，否则会使大部分IgM和少量IgG丧失活性。关于人血清在保存过程中抗体的稳定性报导尚不多。但一般认为作ELISA血清最好要新鲜，若要贮藏，必须少量分装保存于低温冰箱，并防止反复冻融。血浆(xujing)可用肝素毛细管法采血，而血清可用滤纸片法采血。,第二十七页，共44页。,（四）结合物,在ELISA中，用酶标记的抗体或抗原统称为结合物，此为进行ELISA检测的关键试剂(shj)。常规使用ELISA法的主要问题是能够简便地制备酶结合物，而此种制备好的酶结合物要求稳定，具有很高的酶活性，抗原或抗体的特异性，产量高及成本低。,第二十八页，共44页。,（五）洗涤剂与稀释剂,加入(jir)牛血清白蛋白（BSA）和吐温20抑制非特异性蛋白的竞争性吸附作用。,它们有良好的封阻作用,第二十九页，共44页。,（六）底物,（1）底物在未被酶催化以前应该是无色的，而经 酶催化后有明显的颜色变化，这样(zhyng)可使结果分辨清楚；,（2）所显色泽易干洗脱；,（3）显色后的产物要求稳定，在作定量测定时所产生的有色物质应该是可溶性的；,（4）价廉，易得而且无毒。,第三十页，共44页。,（七）作用(zuyng)时间,(1)任意确定(qudng)一个时间，如20分钟或30分钟终止反应，测定被检标本和阳性参考标本的值。这样所得的数据要进行校正，校正可按下