单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,转基因小鼠技术,-,转基因小鼠的构建,转基因小鼠技术 -转基因小鼠的构建,2,基因打靶的简易程序,2基因打靶的简易程序,3,优点：,外源基因整合情况的可控性高,可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性,外源基因导入,ES,细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选方便,缺点：,ES,细胞系建立及培养困难,维持,ES,细胞的未分化及多向分化潜能不易,所得个体为嵌合体,胚胎干细胞（,ES,细胞）法,3优点：胚胎干细胞（ES细胞）法,2024/11/18,4,2023/9/204,2024/11/18,5,主要是利用反转录病毒的长末端重复序列,(LTR),区域具有转录启动子活性的特点,将外源基因连接到,LTR,下游进行基因重组后,再包装成为高滴度病毒颗粒,去,直接感染受精卵或显微注入囊胚腔,中,携带外源基因的反转录病毒,DNA,可以,整合到宿主染色体,上。,3,、逆转录病毒感染法,2023/9/205主要是利用反转录病毒的长末端重复序列(L,6,3,、逆转录病毒感染法,优点,由,于反转录病毒的高效率感染和在宿主细胞,DNA,中的高度整合特性,大大提高基因转移的效率,细菌质粒和噬菌体载体只能将目的基因运载至细菌中扩增和表达。病毒载体是较理想的真核基因工程载体,缺点,获得纯合体的转基因动物的机会少,病毒载体构建复杂,转入的外源基因的大小受到限制,300kb,。,F,因子（,F,质粒）是一种,“,性质粒,”,，可转移至,F,-,宿主细胞。,100kb,近百个蛋白质。,可构建,BAC,文库；,有单一的,loxp,位点，利于图谱分析（借助标记,loxp,和,cre,重组酶；,BAC,载体两端有,Sp6,和,T7,引物序列利于测序，确定基因的,染色体定位；,可稳定遗传，易于操作。,BAC,文库：基因组酶切后,100,300kbDNA+BAC,大肠杆菌,2023/9/20137、BAC法（人工细菌染色体法）建立在,2024/11/18,14,方法,显微注射,核移植,胚胎干细胞,逆转录病毒,基因敲除,精子介导,优点,外源基因整合效率较高，不需要载体，目的基因的长度可达,100Kb,转基因效率高；预测基因表达水平；可以使用定点整合技术,外源,DNA,的整合率高；,整合在生殖细胞中的比例也很高。,可在整合点整合转移基因的单个拷贝；,该方法简单、方便,缺点,精密仪器，技术操作较难，易造成宿主动物基因组的插入突变,供体细胞易衰老,ES,细胞株不易建立，长期培养后出现分化现象；生产的转基因动物都是嵌合体,插入的基因有大小限度；嵌合性很高；,外源,DNA,在动物各种组织中的分布不均,应用具有一定局限性,有些结果不能重复,基因转移方法的比较,2023/9/2014方法显微注射核移植胚胎干细胞逆转录病毒,2024/11/18,15,Electroporation,2023/9/2015Electroporation,2024/11/18,16,电击仪,2023/9/2016电击仪,2024/11/18,17,2023/9/2017,2024/11/18,18,2023/9/2018,2024/11/18,19,2023/9/2019,2024/11/18,20,1,2,3,4,5,6,2023/9/2020123456,2024/11/18,21,1,2,5,6,4,3,2023/9/2021125643,2024/11/18,22,2023/9/2022,2024/11/18,23,2023/9/2023,2024/11/18,24,2023/9/2024,2024/11/18,25,转基因小鼠技术,-,转基因小鼠在科研中的应用,2023/9/2025 转基因小鼠技术-转基因小鼠在科,2024/11/18,26,1.,7500,万,1.25,亿年前,-,人鼠始祖,小鼠的历史,2.,19,世纪,-,宠物鼠,-,实验鼠的“先驱”,3.,1897,年,-,重组表型,2023/9/20261.7500万1.25亿年前-,2024/11/18,27,4.,1900,年,-,从宠物鼠到实验鼠,Abbie Lathrop-,饲养宠物鼠,1902,年，,William Ernest Castle,购买老鼠，用于遗传学研究。哈佛大学,-,老鼠的毛色进行观察，以检测孟德尔法则的正确性。,小鼠的历史,5.,1905,年,-,孟德尔老鼠,通过对黄白相间的杂色鼠进行研究，法国遗传学家,Lucien Claude Cuno,发现，两个携带黄色皮毛基因的老鼠之间交配，其子代老鼠中黄色老鼠和白色老鼠的数量比总是,2:1,。,-,这是报道的第一个等位纯合致死的基因。,2023/9/20274.1900年-从宠物鼠到实验,2024/11/18,28,Clarence Cook Little,是一个来自于,William Castle,实验室的哈佛大学生物学家，他培育出了第一个近亲繁殖的小鼠株系,DBA,。,小鼠的历史,6.,1909,年,-,实验鼠的诞生,Clarence Little,和,Ernest Tyzzer,发现在同一株系小鼠间进行肿瘤移植不会产生排斥现象，但不同株系间的移植则会发生排斥反应。,7.,1916,年,-,肿瘤易受性和组织相容性,Jackson,实验室的,George Snell,在,1940,年代发现了组织相容性基因,-,荣获了,1980,年的,诺贝尔奖,2023/9/2028Clarence Cook Littl,2024/11/18,29,8.,1921,年,-C57BL,株系,基因组,测序在,2002,年完成,小鼠的历史,9.,1929,年,-Jackson,实验室,-,世界上最重要的小鼠遗传学研究中心,在,Hudson,汽车公司的头目,Edsel Ford,和,Roscoe Jackson,两位大财主的资助下，,Charence Little,在美国缅因州,Bar Harbor,建立了,Jackson,实验室,2023/9/20298.1921年-C57BL株系,2024/11/18,30,10.,1953,年,-DNA,双螺旋,Crick,，,Watson,和,Wilkins,三人因为这项杰出的成就荣获了,1962,年的,诺贝尔奖,。,11.,1966,年,-,遗传密码破译,Robert Holly,，,Har Gobind Khorana,和,Marshall Nirenberg,破译了遗传密码,-1968,年的,诺贝尔奖,小鼠的历史,2023/9/203010.1953年-DNA双螺旋,2024/11/18,31,12.,1972,年,-,小鼠遗传学的计算机数据库,Jackson,实验室设计了第一个哺乳动物遗传学计算机数据库,13.,1977,年,-Sanger,测序法,和同事,Walter Gilbert,分享了,1980,年的诺贝尔化学奖,-,人类和小鼠,基因组,测序过程中的主要技术,14.,1982,年,-,转基因,小鼠,小鼠的历史,2023/9/203112.1972年-小鼠遗传学,2024/11/18,32,16.,1987-89,年,-,第一只基因敲除小鼠,Martin Evans,，,Oliver Smithies,和,Mario Capecch,领导的几个研究小组,-2001,获得了,Lasker,奖,17.,1996,年,-“,百慕大法则”,公共,基因组,序列数据,18.,1998,年,-,克隆鼠,1997,年克隆羊“多莉”诞生之后，夏威夷的一个小组培育出了第一批克隆鼠,“Cumulina”,和她的姐妹们。,15.,1983,年,-PCR,Kary Mullis-1993,年的,诺贝尔奖,小鼠的历史,2023/9/203216.1987-89年-第一只,2024/11/18,33,19.,1999,年,-,小鼠,基因组,测序协会,人类,基因组,三个主要测序中心（,The Wellcome Trust Sanger Institute,The Whitehead Center for Genome Research,和,Washington University Genome Sequencing Center,）成立了一个相互协作的小鼠,基因组,测序机构，取名为小鼠,基因组,测序协会（,Mouse Genome Sequencing Consortium,MGSC),20.,2001,年,2,月,-,人类,基因组,21.,2001,年,6,月,-,散弹法,美国公司,Celera Genomics,使用散弹法测得了用于销售的小鼠序列草图。散弹法是一种一次性测得,基因组,全序列的技术。,小鼠的历史,2023/9/203319.1999年-小鼠基因组测,2024/11/18,34,22.,2002,年,5,月,-16,号染色体与已被分析的人类,21,号染色体序列高度相似,23.,2002,年,8,月,-,小鼠,基因组,物理图谱,24.,2002,年,12,月,-,小鼠,基因组,小鼠,基因组,测序协会发表了一份高质量的小鼠,基因组,序列草图，并且同时对,C57BL/6J,小鼠株系做了分析。这个,基因组,大小约为,2.5Gb,，比人类,基因组,要小，预计的基因也少于,30000,个。约有,40%,的小鼠和人类,基因组,序列相高度似性，,80%,的人类基因在小鼠,基因组,中能找到相应的基因。同时还有不少文章对小鼠遗传组成的其它方面做了详细讨论。在日本,RIKEN,基因组,科学实验室的努力下，很多相关的重要资源都能够被免费获取。,小鼠的历史,2023/9/203422.2002年5月-16号染,2024/11/18,35,转基因小鼠技术的应用,基因表达调控、基因功能及发育调控作用的研究,基因工程定向育种,转基因动物生物反应器研制,人类疾病小鼠模型与基因治疗,药理学研究,器官移植,环境科学研究,2023/9/2035转基因小鼠技术的应用基因表达调控、基因,2024/11/18,36,基因表达调控、基因功能及发育调控作用的研究,Hox gene(,同源异形盒基因）,疾病基因,学习与记忆基因,生理周期基因,基因表达有时空与组织的特异性；,外源基因的表达受特异性有关顺式作用序列的调控；,2023/9/2036基因表达调控、基因功能及发育调控作用的,2024/11/18,37,基因工程定向育种,向动物体转移外源基因并使之在动物体内表达，能够克服物种间固有的生殖隔离，实现动物育种之间遗传物质的交换。,实质是将基因转移与传统育种方法结合，各取其精华，快速创造新的目的变异和固定扩展变异，从而快速培育出高产优质和抗逆动物品种。,转基因羊、猪、鸡、鱼、鼠等,2023/9/2037基因工程定向育种向动物体转移外源基因并,2024/11/18,38,转基因动物生物反应器研制,转基因动物生物反应器概念：,将具某种重要应用价值的生物活性蛋白基因导入动物受精卵或早期胚胎，培育转基因动物，使外源基因在动物的特定组织内高效表达，再从这些组织的分泌液、浸出液或血清中分离提取目的基因产物。,乳腺,-,理想器官,肾脏和膀胱,多肽药物、蛋白质疫苗、酶类,细菌,-,动物细胞,-,转基因动物,2023/9/2038转基因动物生物反应器研制转基因动物生物,2024/11/18,39,乳腺生物反应器具有以下特点：,乳腺是自我封闭系统，乳腺表达的蛋白质不回流到血液循,环系统，避免外源基因表达的蛋白质对动物本身的影响；乳腺组织是一种有效的蛋白质合成器；,一头奶牛一年可生产乳蛋白,250,300Kg,，一只绵羊或山羊一年可生产乳蛋白,25,30Kg,。如果有百分之一的乳蛋白代换成医用蛋白，产量十分可观。,乳腺分泌的基因产物不但产量高，而且易提纯。表达的蛋,白经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性。生物活性,接近天然产品；在动物乳腺表达的外源基因可以遗传，可用常规技术繁殖,生产群体。,转基