单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,琼脂糖凝胶电泳检测质粒,DNA,一、实验原理,琼脂糖凝胶电泳：,是常用的用于分离、鉴定及纯化,DNA,分子标准方法，这种电泳方法以琼脂糖凝胶作为支持物，利用,DNA,分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。,实验仪器,：电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等,实验试剂,：琼脂糖，,TAE,电泳缓冲液,，溴化乙锭（,EB,），上,样缓冲液,琼脂糖,是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于,琼脂糖的浓度,。,电泳缓冲液,Tris,乙酸（,TAE,）,Tris,硼酸（,TBE,）,Tris,磷酸（,TPE,）,PH,为,7.58.0,这些缓冲液均含有,EDTA,。,溴化乙锭（,EB,）,溴化乙锭（,EB,）是一种吖啶类染料，它在紫外灯照射下能发射荧光，当,DNA,样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的,EB,就插入,DNA,分子中形成荧光络合物，使,DNA,发射的荧光增强几十倍，电泳后就可直接紫外灯照射下检测琼脂糖中的,DNA,。,上样缓冲液,0.25%,溴酚蓝，,0.25%,二甲苯青，,40%,蔗糖水溶液,0.25%,溴酚蓝，,0.25%,二甲苯青，,30%,甘油水溶液,各成分的作用？,常用的,10X,上样缓冲液,加样缓冲液可以增大样品密度，以确保,DNA,均匀进入样品孔内，还可以使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利。,溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约为二甲苯青,FF,的,2.2,倍,溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约与长,300bp,的双链线性,DNA,相同,而二甲苯青,FF,在琼脂糖凝胶中移动的速率则与,4kb,双链线性,DNA,相同。,迁移方向,DNA,分子在碱性缓冲液中带负电荷,DNA,迁移方向？,点样孔朝向？,DNA,分子大小,DNA,分子的构象,影响,DNA,迁移率的因素,DNA,分子大小,线形的双链,DNA,分子在凝胶中迁移的速率与其碱基数的对数成反比。,分子越大，迁移越慢。一是摩擦阻力越大，二是大分子通过凝胶孔径的效率低于较小的分子。,DNA,分子的构象,不同构象,DNA,分子在电场中移动的距离不同。具有相同分子量的线状、开环状和超螺旋,DNA,在琼脂糖凝胶中移动速度不同。,迁移速度？,二、实验方法,制备,1%,的琼脂糖胶液：取,0.4g,琼脂糖溶于,40mL TAE,中。,在短时间里加热琼脂糖全部熔化。使溶液冷却至,60,。,(,加入,EB,，使,EB,的终浓度为,1g/mL),。,将温热琼脂糖倒入胶床中，凝胶的厚度在,35mm,之间，凝固约,30min,。,在凝胶完全凝固之后，小心移去梳子，将胶床放在电泳槽内，加样孔一侧靠近阴极（黑极）。向电泳槽中注入适量的,TAE,缓冲液，通常缓冲液高于胶面,1cm,。,将适量的质粒样品与加样缓冲液混合,用移液枪将样品加入加样孔。,正确连接电泳槽和电源，设定稳压为,3-5V/cm,。,电泳结束后，在紫外观测仪上进行观察,结果分析,Thanks,