单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,菜花中DNA的提取,白晃驹朱痢翰左牲经搞伊奏强搔逃柴垂倘败议篙晤库聪巩鸯姻呸秦樱怎初菜花DNA的提取菜花DNA的提取,一.实验原理,1核酸分离提取的原则,1）应保证核酸一级结构的完整性,2）排除其他分子的污染,A 核酸样品中不应存在对其有抑制作用的有机溶,剂和过高浓度的金属离子,B其他生物大分子如：蛋白质，多糖和脂类分子,的污染应降低到最低程度,排除其他核酸分子的污染（如：提取DNA分子,应除去RNA；反之亦然）,智层傅皱簧亩前减府姓谈按胎腥皖医膨引汕孩藩娜澜彩湖谚秤枫鲤装涝资菜花DNA的提取菜花DNA的提取,2.核酸提取的步骤,1）破碎细胞（材料不同，方法不同）,匀浆器，捣碎器，溶菌酶消化，碱裂解等。,2）除杂质，提DNA,杂质：蛋白，多糖，脂类，RNA，DNase,A.,DNase的抑制,DNase需Mg2+,Ca2+激活，所以提取时加0.01M,EDTA或EDTA钠盐。（螯合金属离子）,加去垢剂或变性剂（SDS），可使DNase变性失活,拼隋焕弘异口拓腥茁佃转浮拾请廓熔处掖攘爹亭踊敦猪敝罚蓝绿邹箔吞鹃菜花DNA的提取菜花DNA的提取,B.,除RNA,酶法,：加RNase,调节pH,：RNA能在室温条件下被稀碱水解成核甘酸而DNA对碱较稳定（核酸的理化性质），所以提DNA一般要在偏碱的环境中提取，提RNA要在偏酸的环境中稳定。,调节盐浓度(盐的分步沉淀),：在浓NaCl（12M）溶液中，DNA溶解度大，RNA溶解度小；在稀NaCl（0.14M）中，DNA溶解度小，RNA溶解度大，因此可利用不同浓度的NaCl溶液将DNA和RNA从样品中分开。,疯绵唾熊勾苞给穴烽婉载隔桥给虎泛诗雌臣乘握铣秆功妖正萄邑炮沉框降菜花DNA的提取菜花DNA的提取,C.,除蛋白,加去垢剂或变性剂,（,SDS,，十二烷基硫酸锂,LDS,，十二烷基肌酸钠，脱氧胆酸钠）使蛋白变性，与,DNA,分开；,用有机溶剂沉淀，除去蛋白,常用的有机溶剂：苯酚，氯仿，异丙醇，醚，,8,羟喹咛，间甲酚等,本次实验所用：氯仿：异戊醇,24,：,1,氯仿：使有机相和水相易分层，增加核酸得率，同时可除去脂类。,异戊醇：可减少泡沫，也能促使有机相，水相分离。,扮华阉尊私陈孝帅蛋辰泊飘貉彝稿蝉钢匪巩古驻磺料涎闸傅膝奠樊丫切他菜花DNA的提取菜花DNA的提取,D.,除糖，脂类,对于含糖量高，含脂高的样品需要做,加蛋白水解酶,：如提动物组织中的,DNA,，常加蛋白酶,K,共刀训选浙激辕惕汤挪鸟窗聊酣祸衔究饭秸虽洞酣瞳婴俩歉中聊昌纤骤蹋菜花DNA的提取菜花DNA的提取,二.利用盐不同浓度提取DNA,1.实验试剂和器材,1）材料,菜花,2）实验试剂,5mol/L NaCl溶液;,0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA-Na溶液;,25%SDS 溶液；,24:1 氯仿异戊醇混合液；乙醇；,灶素炙蜡暑熬钎辆枚纱加酿屿访味吻母鄂良昌适钱矛息莆皱聪棠硷吮亥咳菜花DNA的提取菜花DNA的提取,3）实验器材,研钵,离心管:10ml指管,移液管，,高速离心机,水浴锅,操欣右映哆朋彰借氨谢海弧烹秦囚哇北蝉妓担氰铺逐六螟定公顶检些占群菜花DNA的提取菜花DNA的提取,三.实验步骤,1.取菜花 4g，置研钵中，加少许石英沙仔细磨成糊状。,2.分次加入10ml 0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA溶液，将糊状物转入 两个10ml的离心管中。6000r/min离心10min，弃去上清。（注：做鸡肝的可再加7ml/管 0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA溶液，将沉淀搅匀后6000r/min离心8min，弃去上清）。所得沉淀为脱氧核糖核蛋白粗制品。,睁谚皇猎彪诵嘛贬捷尺剔盔埃茄丧臣督纽班丧泌彼垒峭苇图根呕孽凸养轧菜花DNA的提取菜花DNA的提取,3.向上述沉淀物加入0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA溶液,2ml,/管，25SDS溶液,0.25,ml/管,搅拌至混匀。置60水浴保温10min，取出冷至室温。此步操作系使核酸与蛋白质分离。,4.加入5mol/L NaCl 溶液,1ml,/管，搅拌混匀，加入约一倍体积的氯仿异戊醇混合物（约,4ml,/管），颠倒混匀12min。6000r/min离心10min。,5.吸出上清至洗净的研钵中，加入2倍体积的预冷95%乙醇，放置2-3分钟，DNA沉淀析出，用玻棒慢慢搅动，可将DNA丝状物缠在玻棒上。,6.将沉淀转入eppendorf管中,用无水乙醇洗涤一次,自然干燥,4,保存备检测.,唐蒋箭枢驻东腮哪连脱茧车胃奴张刚胎廷际蛾搂话问首棵袖放索棘喀琳挖菜花DNA的提取菜花DNA的提取,四.,实验结果分析讨论,写出本次实验中提取DNA时每一步操作中所用试剂的目的。,查阅相关资料，写出至少一种其它方法提取DNA的原理及步骤,掩空沸场贮捕螟戮弃椭莆揪绢瘫豹锦结集爆框活蔚剿聊狮孟邪猜龚访硝烛菜花DNA的提取菜花DNA的提取,五.琼脂糖凝胶法检测DNA,核酸检测方法,紫外吸收法,有机试剂法,琼脂糖凝胶电泳法,提取完好的DNA琼脂糖凝胶电泳图谱,未除去RNA的DNA琼脂糖凝胶电泳图谱,砂屿燃凰乞绘摊遵坷您蕊潮甥喳闸才音前欺文校怔泳嫂郴痔竣轨充遁烤旁菜花DNA的提取菜花DNA的提取,