,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,离心分离技术,1,离心分离技术1,离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异进行分离、浓缩和提纯的一种方法。颗粒的沉降速度取决于离心机的转速及其自身与中心轴的距离。不同大小、形状和密度的颗粒会以不同的速度沉降。,2,离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异,类型,普通离心机,高速离心机,超速离心机,最大转速(r/min),6000,25000,可达75000以上,最大RCF（g）,6000,89000,可达510000以上,分离形式,固液沉淀,固液沉淀分离,密度梯度区带分离或差速沉降分离,转子,角式和外摆式转子,角式、外摆式转子等,角式、外摆式、区带转子等,仪器结构性能和特点,速率不能严格控制，多数室温下操作,有消除空气和转子间摩擦热的制冷装置，速率和温度控制较准确、严格。,备有消除转子与空气摩擦热的真空和冷却系统，有更为精确的温度和速度控制、监测系统、有保证转子正常运转的传动和制动装置等。,应用,收集易沉降的大颗粒（如RBC、酵母细胞等）,收集微生物、细胞碎片、大细胞器、硫酸铵沉淀物和免疫沉淀物等。但不能有效沉淀病毒、小细胞器（如核糖体）、蛋白质等大分子。,主要分离细胞器、病毒、核酸、蛋白质、多糖等甚至能分开分子大小相近的同位素标记物,15,N-DNA和未标记的DNA。,3,类型普通离心机高速离心机超速离心机最大转速(r/min)60,基本原理,离心力（centrifugal force，Fc）离心作用是根据在一定角度速度下作圆周运动的任何物体都受到一个向外的离心力进行的。离心力（Fc）的大小等于离心加速度,2,X与颗粒质量m的乘积，即：,其中是旋转角速度，以弧度/秒为单位；X是颗粒离开旋转中心的距离，以cm为单位；m是质量，以克为单位。,4,基本原理 离心力（centrifugal force，,相对离心力（relative centrifugal force，RCF）,由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力而受变化，因此在文献中常用“相对离心力”或“数字g”表示离心力，只要RCF值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。RCF就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。,式中X为离心转子的半径距离，以cm为单位；g为地球重力加速度（980cm/sec,2,）；n为转子每分钟的转数（rpm）。,5,相对离心力（relative centrifugal fo,将离心机转数换成相对离心力时，先在离心机半径标尺上取已知的离心机半径和在转数标尺上取已知的离心机转数，然后将这两点间划一条直线，在图中间RCF标尺上的交叉点，即为相应的离心力数值。例已知离心机转数为2500rpm，离心机的半径为7.7cm，将两点连接起来交于RCF标尺，此交点500g即是RCF值。,6,将离心机转数换成相对离心力时，先在离心机半径标尺上取已知的离,离心技术的分类,7,离心技术的分类7,（一）,差速离心,Differential centrifugation,它利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别，在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分部沉淀。操作过程中一般是在离心后用倾倒的办法把上清液与沉淀分开，然后将上清液加高转速离心，分离出第二部分沉淀，如此往复加高转速，逐级分离出所需要的物质。,差速离心的分辨率不高，沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取。,8,（一）差速离心 Differential centrifug,Low speed,High speed,Differential centrifugation,9,Low speedHigh speedDifferentia,特点：,介质密度均一；,速度由低向高，逐级离心。,用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。,沉降顺序：核线粒体溶酶体与过氧化物酶体内质网与高基体核蛋白体。,可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。,10,特点：10,11,11,（二）密度梯度离心,又称密度梯度区带离心,是在有密度梯度的惰性密度梯度的介质液中进行离心沉降或沉降平衡，即在一定离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的离心方法。,12,（二）密度梯度离心又称密度梯度区带离心,是在有密度梯度的惰,用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞和细胞成分分层、分离。,类型：速度沉降、等密度沉降。,常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。,分离活细胞的介质要求：,1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；,2）PH中性或易调为中性；,3）浓度大时渗透压不大；,4）对细胞无毒。,13,用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或,（一）,速率区带离心法,将样品置于平缓的预先制好密度梯度介质上，进行离心，较大的颗粒将比较小的颗粒更快地沉降通过梯度介质，形成几个明显的区带（条带）。,差速区带离心法仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒，与密度无关。大小相同、密度不同的颗粒（如溶酶体、线粒体和过氧化物酶体）不能用本法分离。,离心时，由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同沉降速率沿管底沉降。离心一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，最后形成一系列界面清楚的不连续区带。沉降系数越大，往下沉降的越快，所呈现的区带也越低。沉降系数较小的颗粒，则在较上部分依次出现。,14,（一）速率区带离心法14,从颗粒的沉降情况看来，离心必须在沉降最快的颗粒（大颗粒）到达管底前或刚到达管底时结束，使颗粒处于不完全的沉降状态，而出现在某一些特定的区带内。,在离心过程中，区带的位置和形状（或带宽）随时间而改变，因此，区带的宽度不仅取决于样品组分的数量、梯度的斜率、颗粒的扩散作用和均一性，也与离心时间有关。时间越长，区带越宽。适当增加离心力可缩短离心时间，并可减少扩散导致的区带加宽现象，增加区带界面的稳定性。,15,从颗粒的沉降情况看来，离心必须在沉降最快的颗粒（大颗粒）到达,速率区带离心法,用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。,特点：介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。,原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。,16,速率区,2.,等密度沉降,isopycnic sedimentation,等密度离心,被分离的样品中颗粒的密度在密度梯度液密度范围内，在离心过程中，颗粒沉或浮分别移动到与梯度液某密度相等处而成为一悬浮层，此种密度梯度离心方式称为等密度离心。,它与密度梯度沉降离心不同，是被分离样品中的各种颗粒的密度在整个密度梯度液的范围内，介质的梯度密度往往是利用强大的离心力使组成梯度液的成份自形成密度梯度，当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力的作用下，颗粒或向下沉降或向上浮起，一直沿梯度移动到与它们恰好相等密度梯度的位置上（即等密度点）形成区带层。,17,2.等密度沉降 isopycnic sedimentatio,用途：分离密度不等的颗粒。,特点：,介质密度高，陡度大，介质最高密度大于被分离组分的最大密度。,力场比速率沉降法大10100倍，需要高速或超速离心。,原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。,18,用途：分离密度不等的颗粒。18,