,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,HIV,抗体检测技术,HIV抗体检测技术,1,艾滋病诊断的特殊性,高度依赖实验室诊断,HIV,检测的严肃性：,保证输血、器官移植的安全,错误结果将导致严重的法律问题,结果严格保密,艾滋病诊断的特殊性 高度依赖实验室诊断,2,艾滋病病毒的形态,艾滋病病毒的形态,3,HIV,的逆转录酶缺乏,3,5,核酸外切酶活性，无法修复逆转录和复制过程中发生的错误。,HIV,颗粒,HIV的逆转录酶缺乏35核酸外切酶活性，无法修复逆转,4,艾滋病病毒的结构,艾滋病病毒的结构,5,HIV,生活周期,吸附穿入脱壳生物合成组装成熟和释放,HIV生活周期吸附穿入脱壳生物合成组装成熟和释放,6,HIV-1,通过,gp120,与靶细胞表面,CD4,分子和趋化因子受体结合,HIV-1通过gp120与靶细胞表面CD4分子和趋化因子受,7,HIV,感染后的血清学改变,HIV感染后的血清学改变,8,诊断：确定个体,HIV,感染状况而进行的检测，包括临床检测和自愿咨询检测、术前检测、根据特殊需要进行的体检等。,监测：了解不同人群,HIV,感染率及其变化趋势而进行的检测，检测的人群包括各类高危人群和一般人群。,血液筛查：防止输血传播,HIV,而进行的检测，包括献血员筛查和原料血浆筛查。,HIV,抗体检测目的,HIV抗体检测目的,9,筛查试验,初筛,复检,确证试验,HIV,抗体检测程序,筛查试验HIV抗体检测程序,10,筛查试验,筛查试剂,必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、在有效期内的试剂，其中酶联免疫试剂应批批检合格。推荐使用临床质量评估敏感性和特异性高的试剂。,HIV,抗体筛查样品,血清、血浆、,滤纸干血斑,、唾液和尿液。,筛查试验筛查试剂,11,筛查方法,酶联免疫吸附试验（,ELISA,）,化学发光或免疫荧光试验（,CLIA,）,：采用发光或荧光底物，用发光或荧光仪测定结果。,快速检测（,RT,）及其它检测试验,(1),明胶颗粒凝集试验,(PA),(2),斑点,EIA,和斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验,(3),免疫层析试验,HIV,抗体筛查试验,筛查方法HIV抗体筛查试验,12,初筛试验,对呈阴性反应的样品，可出具,HIV,抗体阴性（,-,）报告；对呈阳性反应的样品，需要进一步做复检试验和确证试验。,复检试验,对初筛呈阳性反应的样品，应使用原有试剂和另外一种不同原理（或厂家）的试剂，或另外两种不同原理或不同厂家的试剂进行复检试验。,如果初筛检测使用抗原抗体联合试剂，则复检必须包括一种抗原抗体联合试剂。,艾滋病检测筛查实验室复检判定为阳性反应的样品，确证实验室可以直接进行确证试验。,初筛试验,13,样本,初筛检测,一阴一阳,均阳性反应,阴性报告,送确认,重复检测,阴性报告,均阴性反应,阳性反应,原有试剂另一,种原理初筛试剂,选用初筛试剂,阴性反应,HIV,抗体筛查检测流程图,样本初筛检测一阴一阳均阳性反应阴性报告送确认重复检测阴性,14,(1),酶联免疫吸附试验（,ELISA,）,可使用血液、唾液、尿液样品,单纯,HIV,抗体检测试剂,HIV,抗原抗体联合检测试剂：同时检测血液中,HIV-1P24,抗原和,HIV-1/2,抗体。,HIV,抗原或抗体包被于固相载体，加入待检样品和酶标记的,HIV,抗原或抗体，加底物显色，用酶标仪测定结果。有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定。,(1)酶联免疫吸附试验（ELISA）可使用血液、唾液、尿液样,15,四代艾滋病酶联免疫试剂比较,solid,phase,specific,detection of,conjugate,第一代,病毒裂解液,HIV-1,IgG,抗体,HIV-1,-,IgG,抗体,第二代,病毒裂解液,重组抗原合成肽,HIV-1/-2,IgG,抗体,HIV-1/-2,IgG,抗体,第三代,病毒裂解液,重组抗原合成肽,HIV-1/-2/-O,IgM/IgG,抗体,HIV-1/-2/-O,病毒裂解液,重组抗原合成肽,HIV-1/-2/-O,第四代,病毒裂解液,重组抗原合成肽,HIV-1/-2/-O,anti-p24 Ab,IgM/IgG,抗体,HIV-1/-2/-O,p24,抗原,病毒裂解液,重组抗原合成肽,HIV-1/-2/-O,anti-p24,抗体,method,间接,间接,夹心,夹心,四代艾滋病酶联免疫试剂比较solidspecificconj,16,固相抗原,标本（含抗体）,酶标二抗,底物,E,E,E,间接法检测抗体,固相抗原标本（含抗体）酶标二抗底物EEE间接法检测抗体,17,E,固相抗原,标本（含抗体）,酶标抗原,底物,E,E,双抗原夹心法检测抗体,E固相抗原标本（含抗体）酶标抗原底物EE双抗原夹心法检测抗体,18,ELISA,测定中的干扰因素,内源性干扰因素,外源性干扰因素,ELISA测定中的干扰因素内源性干扰因素,19,内源性干扰因素,类风湿因子、补体、异嗜性抗体、治疗性抗体、自身抗体、溶菌酶、磷脂、药物小分子等,内源性干扰因素,20,外源性干扰因素,溶血、细菌污染、标本贮存时间过长、凝固不全、反复冻融,外源性干扰因素溶血、细菌污染、标本贮存时间过长、凝固不全、反,21,操作中的注意事项,加样,温育,洗板,显色,操作中的注意事项加样,22,标准化操作及流程,试剂准备、标本收集、测定方法和仪器操作写出正确的,“标准操作程序”,(SOP),，,所有的实验技术人员在进行相关测定时，必须严格按相应的,SOP,进行操作。,标准化操作及流程 试剂准备、标本收集、测定,23,ELISA,法结果判断,临界值概念,:,将检测的阳性和（或）阴性对照的,OD,值代入计算公式计算出来的判断阳性和阴性结果的界值,判断标准,:,标本,OD,值与临界值的比值大于等于,1(S/CO1),为阳性（对间接法及双抗原夹心法）,注意,:,不同厂家、不同方法临界值计算公式不同,cutoff=NC+0.1(0.15,0.12)cutoff=NC*2.1,ELISA法结果判断临界值概念:将检测的阳性和（或）阴性对,24,酶联免疫吸附试验（,ELISA,）,优点：准确性高、价格低廉、判断结果标准客观、结果便于记录和保存,用途：流行病学监测及临床大量标本的检测,酶联免疫吸附试验（ELISA）优点：准确性高、价格低廉、判断,25,(2),化学发光或免疫荧光试验,采用发光或荧光底物，既可检测抗体，也可联合检测抗原抗体。,HIV,抗原或抗体包被于固相载体，加入待检样品和酶或荧光标记的,HIV,抗原或抗体，加发光或荧光底物，用发光或荧光仪测定结果。有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定。,(2)化学发光或免疫荧光试验采用发光或荧光底物，既可检测抗体,26,（,3,）快速检测（,RT,）及其它检测试验,优点,:,试验简便快速，适用于应急检测、门诊急诊检测。,不需专门设备和人员培训,一般可在,10,30,分钟内得出结果。,缺点,:,肉眼判断较主观、价格较贵、结果不易保存。,（3）快速检测（RT）及其它检测试验优点:试验简便快速，适用,27,（,1,）明胶颗粒凝集试验（,PA,）,将,HIV,抗原致敏明胶颗粒作为载体，与待检样品作用，混匀后保温（一般为室温）。当待检样品含有,HIV,抗体时，经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原,-,抗体反应，根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判读结果。,快速诊断试剂,（1）明胶颗粒凝集试验（PA）快速诊断试剂,28,PA,法原理,PA法原理,29,（,2,）斑点,EIA,和斑点免疫胶体金（或胶体硒）,以硝酸纤维膜为载体，,HIV,抗原点状固定在膜上,加血清样品。,斑点,EIA,法用酶标记抗体，以后步骤同,ELISA,。,斑点免疫胶体金（或胶体硒）用红色的胶体金（或胶体硒）,A,蛋白标记，用渗滤法作为洗涤方法。,阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。反应时间在,10 min,以内，使用抗原量少。,快速诊断试剂,（2）斑点EIA和斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速诊断试剂,30,金标诊断试验原理,金标诊断试验原理,31,快速诊断试验,快速诊断试验,32,（,3,）,免疫层析试验,(,金标法、硒标法,),以硝酸纤维膜为载体。,加样区：预包被胶体金,-,抗原,/,胶体金,-protein A,结合物,测试区（,T,）：固定有重组,HIV,抗原，,质控区：抗,HIV,单克隆抗体,/,抗,-protein A,抗体,快速诊断试剂,（3）免疫层析试验(金标法、硒标法)快速诊断试剂,33,全血样品,加,50ul,样品于样品垫中,手指血方法,静脉血方法,加一滴缓冲液,15,分钟内读取结果,硒标法操作步骤,全血样品手指血方法静脉血方法加一滴缓冲液15分钟内读取结果硒,34,HIV检测技术-课件,35,病人条,质控条,病人条质控条,36,快速诊断试验,快速诊断试验,37,优点,:,试验简便快速，适用于应急检测、门诊急诊检测。,不需专门设备和人员培训,一般可在,10,30,分钟内得出结果。,缺点,:,肉眼判断较主观、价格较贵、结果不易保存。,注意：一定要将试剂平衡至室温,快速诊断试剂,优点:试验简便快速，适用于应急检测、门诊急诊检测。不需专门设,38,HIV,抗体确认试验,确认试验的试剂：,必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、在有效期内的试剂。,确认试验方法：,免疫印迹试验,(WB),条带免疫试验,(LIATEK HIV),放射免疫沉淀试验,(RIPA),及免疫荧光试验,(IFA),国内常用的确认试验方法是,WB,。,HIV抗体确认试验确认试验的试剂：,39,HIV,抗体确认实验结果,a,强阳性对照（,HIV-1,和,HIV-2,）,b,弱阳性对照（,HIV-1,）,c,阴性对照,d,典型的,HIV-2,血清阳性反应,a b c d,gp160,gp120,p66,p55,p51,gp41,p39,p31,P24,p17,血清对照,HIV-2,特异带,HIV抗体确认实验结果a 强阳性对照（HIV-1和HIV-2,40,WB确认HIV感染的判定标准和判定结果的基本原则,HIV-1抗体阳性：gp41和Gp120/gp160或加上gp41加上P24,阴性：无HIV抗体特异带出现。,可疑：出现HIV抗体特异条带，但不足以判定阳性,WB确认HIV感染的判定标准和判定结果的基本原则 HIV-1,41,HIV,抗体确认试验不确定结果,P24,：非特异性反应（孕妇，正常人）,Gp160,：非特异性反应，感染早期，感染晚期,Gp160,，,gp120,：非特异性反应，感染早期，感染晚期,Gp160,，,p24,：非特异性反应，感染早期，感染晚期,HIV抗体确认试验不确定结果P24：非特异性反应（孕妇，正,42,HIV,抗体确认试验不确定结果,P24,：非特异性反应（孕妇，正常人）,Gp160,：非特异性反应，感染早期，感染晚期,Gp160,，,gp120,：非特异性反应，感染早期，感染晚期,Gp160,，,p24,：非特异性反应，感染早期，感染晚期,Gp160,，,gp120,，,p24,：感染早期，感染晚期,污染？,HIV抗体确认试验不确定结果P24：非特异性反应（孕妇，正,43,筛查试验阳性反应样品,HIV,抗体,确证检测流程图,结合流行病学资料，可以在,4,周后随访检测，如带型没有进展或呈阴性反应，,则报告阴性；如随访期间出现阳性反应，