单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,血清碱性磷酸酶活性测定,（磷酸苯二钠法）,问题,1,：,为何要测定血清中酶的活性？有什么意义？,酶活性测定是目前临床酶学分析最为常用的方法。酶测定约占目前临床生化总工作量的,1/4,到,1/2,。,用于诊断的酶类已超过,100,多种，常用的数十种。,引言（1）,血浆酶,血浆特异酶,非血浆特异酶,外分泌酶,细胞内酶,血浆酶的来源,（一）血浆特异酶,在血浆中发挥特定催化作用的酶。如凝血酶、胆碱酯酶（,CHE,）、脂蛋白脂肪酶、铜氧化酶等。,它们大多数在肝内合成，在血浆中的浓度甚至超过器官细胞内浓度。有的可以作为肝功能试验的一部分。,血浆特异酶活性的改变，除了反映血液功能外，还反映来源器官的功能。,（二）非血浆特异酶,在血浆中浓度很低，且无功能，分为两种。,1.,分泌酶：,来源于消化腺或其他外分泌腺的酶。如,-,淀粉酶（,AMY,）、前列腺酸性磷酸酶（,ACP,）、脂肪酶（,LPS,）、胃蛋白酶原、胰蛋白酶原、,ALP,等。,正常体液中外分泌酶活性低而稳定，不发生催化作用。,在血液中的浓度和其分泌腺体的功能活动和疾病有关，来源增加或排泄受阻时，血浆中此类酶活性增高。例如，急性胰腺炎时，血淀粉酶就会升高。,2.,代谢酶：（细胞酶）,在细胞内发挥催化功能的酶。正常时这些酶存在于组织细胞中，血浆中酶活性很低。细胞内、外浓度差异悬殊。,当酶来源的组织细胞发生病变，细胞膜通透性增加或细胞坏死时，细胞内酶大量进入血浆，导致血浆酶活性显著增高。其下降的临床意义很少。,这一类酶临床应用较多，如转氨酶、乳酸脱氢酶、肌酸激酶等，它们在肝病、心脏疾病时都可能出现变化。,一些酶在,不同器官、组织、细胞内的分布和定位存在明显差异,，而且在细胞内外有明显浓度梯度差。,正常情况下血浆中酶活性相对恒定。但一些,病理情况,常导致血浆中酶活性的改变。性别、年龄、运动、妊娠、人种及环境因素等可引起人血浆中某些酶的,生理性,变化。,所以酶与其它指标相比具有更高的诊断特异性和灵敏度。,引言（2）,诊断常用血清酶,血清酶 符号 来源,鸟氨酸氨基甲酰转移酶,OCT,肝,卵磷脂胆固醇酰基转移酶,LCAT,肝,谷氨酸脱氢酶,GLDH,肝,山梨醇脱氢酶,SDH,肝,丙氨酸氨基转移酶,ALT,肝、肾、心,异柠檬酸脱氢酶,ICD,肝、胎盘、心,-,谷氨酰转肽酶 ,-GT,肝、胆、肾、小肠,5-,核苷酸酶,5-NT,肝、胆道,单胺氧化酶,MAO,肝、肾、脑,天门冬氨酸氨基转移酶,AST,心、肝、骨骼肌,肌酸激酶,CK,骨骼肌、心、脑,乳酸脱氢酶,LDH,心、肾、骨骼肌、肝、肺,碱性磷酸酶,ALP,骨骼、牙齿、肝、肾,酸性磷酸酶,ACP,前列腺、红细胞、血小板,淀粉酶,AMS,胰、唾液腺,脂肪酶,LPS,胰,碱性磷酸酶,(Alkaline phosphatase,ALP or AKP),A,LP,几乎存在于机体各个组织，但以骨骼、牙齿、肝脏和肾脏中含量较多，儿童期含量尤其多。,ALP,有六种同功酶。其中,AKP1,、,AKP2,、,AKP6,来自,肝脏,，,AKP3,来自,骨细胞,，,AKP4,产生于,胎盘及癌细胞,，而,AKP5,来自,小肠绒毛上皮与成纤维细胞,。,临床上测定,ALP,活性主要用于肝脏疾病和骨骼疾病的诊断。,当肝脏受到损伤或者障碍时经淋巴道和肝窦进入血液，同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍，反流入血而引起血清碱性磷酸酶明显升高。,是一种能够将对应底物,去磷酸化,的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的,磷酸基团,除去，并生成,磷酸根离子,和,自由的羟基,，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的过程称为去磷酸化或脱磷酸化。,碱性磷酸酶在碱性环境中有最大活力。,什么是,ALP?,问题,1:,为什么要测定碱性磷酸酶的活性？有什么意义？,1.,生理性增加：如儿童、妊娠期、进食高糖、高脂肪食物等均可使血清,ALP,活性增高。,2.,病理性改变：,升高,（,1,）,肝胆疾病,。,主要见于阻塞性黄疸，急、慢性黄疸性肝炎，肝癌等均可引起血清,ALP,活力不同程度的升高，其中以癌性梗阻最明显。,（,2,）,各种骨骼疾病,。,ALP,主要由成骨细胞产生，故骨骼病特别是有新生骨质生成时，血液内,ALP,活性增加，以促进磷酸盐的沉积。如佝偻病、纤维性骨病、成骨不全症、骨转移癌和骨折修复愈合期等均引起血清,ALP,活力升高。,降低,：主要见于呆小症，磷酸酶过少症等。,问题,2,：,如何测定酶活性？,酶活性,：,酶催化某一化学反应的能力,常用,单位时间内底物的减少量或产物的生成量,（,即,酶促反应速度,）,来表示酶活性大小,酶活性的概念,注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的生成量为好。,固定时间法：,（终点法）,通常是酶作用一段时间后，,加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应,，,测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量,，计算酶促反应的,平均速度,。,连续监测法：,（速率法）,连续监测法是指,每隔一定时间（,2,60s,）,，连续多次测定酶反应过程中某一反应,产物或底物量随时间变化的数据,，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法。,适用于,自动生化分析仪,能动态观测酶促反应进程，结果准确可靠，标本和试剂用量少，可在较短时间内完成测定。,酶活性的测定方法,酶偶联测定法,应用,：对于底物或产物不能直接测定或难于准确测定的酶促反应。,Ex,Ea Ei,A B C P,式中,A,为底物，,B,、,C,为中间产物，,P,为产物（必须能够直接测定），,Ex,为待测酶，,Ea,、,Ei,都为工具酶,。按照工具酶作用的不同，,Ea,又称为辅助酶，,Ei,又称为指示酶，,C P,称为指示反应,。,问题,3,：,在酶促反应进程中，是否,任一阶段的酶促反应速度,都可以代表酶活性？,酶促反应进程曲线,能够真正代表酶活性大小的是,线性期,的酶促反应速度，,即酶促反应初速度,。,酶的含量,酶活性,酶促反应初速度,问题,4,：,测酶活性应注意哪些方面？,合适的底物与最适底物浓度,底物浓度远远高于酶浓度,理想的缓冲液与最适离子强度,最适温度,最适,pH,合适的辅因子、激活剂浓度,合理的测定时间,对于,固定时间法，,需在酶作用一段时间后，,加入合适的终止剂终止酶促反应,。,尽量去除各种抑制剂,酶最适反应条件的选择,问题,5,：,如何表示酶活性大小？,酶活性单位,定义：,在,一定条件,下，,一定时间,内将,一定量的底物,转化为产物（或得到,一定量的产物,）所需要的,酶量,。,分类：,惯用单位：,酶活性测定方法的建立者所规定的单位。,国际单位,(International unit,IU),：,指在规定条件,（最适,pH,，最适底物浓度）,下，,每分钟转化,1,mol,底物的酶量,。,单位为,IU/L,。,Kat,单位：,指在规定条件下，,每秒钟转化,1mol,底物,的酶量，,1Kat=6,10,7,IU,。,酶的活力单位,国际单位：,Katal,，,1s,转化,1mol,底物的酶量,临床表示：,Kings,，如血清谷丙转氨酶活力单位，每,100ml,血清在,37,。,pH=7.4,的条件下与底物作用,60min,，生成,1mol,丙酮酸所需的酶量为,1,个活力单位,酶的比活力：单位质量酶蛋白或单位体积酶制剂所含有酶活力单位数，即酶活力浓度。,酶活力的测定方法,1.,终止测定法（定时法或终点法）,2.,动力学分析法（连续监测法或速率法）,目录,ONTENTS,C,壹,实验目的,贰,实验原理,叁,实验器材与试剂,肆,实验操作,壹,实验目的,熟悉血清碱性磷酸酶活性的测定方法（磷酸苯二钠法）,掌握血清碱性磷酸酶测定的临床意义,贰,实验原理,测定,ALP,活性的方法主要分为,两种,一是测定底物解离下的,磷酸根,来计算酶活力，如,-,甘油磷酸钠法,，但存在血清本身有磷酸根的缺点,二是测定底物解离磷酸根后的,羟基化合物,，这种方法又可分为：,酚化合物在,显色剂,的作用下显色比色测定（如,本次实验方法,）,。,生成的酚化合物本身在一定的条件下就可显色，如,对硝基苯磷酸二钠（,PNPP,）法。,无色的对硝基苯磷酸二钠在,ALP,的作用下，生成在,405nm,处有特异吸收的淡黄色对硝基苯酚。通过测定在,405nm,处吸光度的变化速率来计算,ALP,的活性。,磷酸苯二钠法,在,pH10,环境中，,ALP,催化,磷酸苯二钠,水解生成,苯酚,和磷酸氢二钠。,苯酚,在碱性溶液中与,4-,氨基安替比林,作用，经,铁氰化钾,氧化生成,醌衍生物,。,可根据,红色深浅,测定酶活性的大小。,4-,氨基安替比林,（铁氰化钾）,+,苯酚,红色醌亚胺衍生物,磷酸苯二钠,+H2O,(ALP,PH=10),苯酚,+,磷酸氢二钠,叁,实验器材与试剂,（一）器材：5ml移液管，1ml移液管，100或200ul微量可调式移液器，721E分光光度计，1cm比色皿，37 恒温水浴,（二）试剂：,1,、,碳酸盐缓冲液,(0.1mol/L,，,pH10.0,),：溶解无水碳酸钠,6.36g,，碳酸氢钠,3.36g,。,4-,氨基安替比林,1.5g,于蒸馏水,800ml,中，将此溶液转入,1L,容量瓶内，加蒸馏水到刻度。棕色瓶中贮存。,2、,20mmol/L磷酸苯二钠溶液,先将500ml蒸馏水煮沸，迅速加入,磷酸苯二钠,2.18g(磷酸苯二钠如含2分子结晶水，则应称取2.54g)，冷却后加氯仿2ml防腐，在4冰箱保存。（用剩的溶液不应再倒回瓶中）,淡黄色结晶。熔点,109,。溶于水、苯和乙醇，微溶于乙醚。,3、,铁氰化钾的硼酸溶液,称取铁氰化钾2.5g，硼酸17g，各自溶于蒸馏水400ml中，两液混合后，加蒸馏水至1L，置棕色瓶中避光保存(如出现蓝绿色即弃去)。,4、,酚标准工作液（0.05mg/ml）：,购买合格的二级标准品。,4,一氨基安替比林用量与吸光度成正相关，需准确加入。铁氰化钾用量不足时，反应不完全，测量结果偏低，因此铁氰化钾用量必须加足或稍稍过量,本实验采用终止法；终止剂是 铁氰化钾硼酸液；硼酸改变了,PH,，使其不再处于最适,PH,。,肆,实验操作,立即混匀。用,510nm,波长,（红色醌物质的最大吸收波长）,比色，以蒸馏水调零点，读取各管吸光度。,保持反应时温度是均衡的，,37C,取试管4支，按下表操作,实验过程两次水浴保温，一次,5min,，一次,15min,。前者是达到最适温度，后者是反应时间,ADD YOUR TITLE HERE,1,2,单击此处编辑您要的内容，建议您在展示时采用微软雅黑字体，本模版所有图形线条及其相应素材均可自由编辑、改色、替换。更多使用说明和作品请详阅模版最末的使用手册。,单击编辑标题,单击此处可编辑内容，根据您的需要自由拉伸文本框大小,单击此处可编辑内容，根据您的需要自由拉伸文本框大小,【,注意事项,】,1,、铁氰化钾溶液中加入硼酸有稳定最后所显色的作用。此液应避光保存，如出现蓝绿色即作废。,2,、底物液中不应含有酚，如含有酚时空白管显红色，说明磷酸苯二钠已开始分解，不宜继续使用。,3,、,加入铁氰化钾后,必须迅速混匀,(,为了改变,PH,来终止酶促反应）否则对实验结果有影响，偏大。,4,、一般血清标本可以共用对照管，,黄疸血清及溶血血清应分别作对照管,5、目前市售的酚标准液多数为安瓿瓶，开后不能久置,计算,ALP活性=（A,测定,A,对照,）/（A,标准,A,空白,）*0.05*100(金氏单位）,金氏单位定义,每,100ml,血清,在,37,与底物作用,15,分钟,，产生,1mg,酚,为,1,个金氏单位,。,参考值,成人：,313,金氏单位,儿童：,528,金氏单位,临床意义：,血清中ALP活力测定在临床常作为肝胆疾病和骨骼疾病的临床辅助诊断指标。,1,血清ALP活性升高可能原因如下,：肝胆疾病：阻塞性黄疸、急性或慢性黄疸性肝炎、肝癌等；骨骼疾病：由于骨的损伤或疾病使成骨细胞内所含高浓度的ALP释放进入血液中，