单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,小田, www.iloveppt.org,*,基于质谱分析的蛋白质组学,蛋白质组学,01,02,03,生物质谱技术,生物质谱在蛋白质组学中的研究利用,Content,蛋白质组学,蛋白质组（proteome）:PROTEins+genOME， 意为protein expressed by genome,基因组表达的全部蛋白质,蛋白质组学（proteomics）:The study of the proteome,研究全部蛋白质的存在及存在形式的一门学科,根据研究目的，蛋白质组学可分为,表达蛋白质组学 (expression proteomics）,结构蛋白质组学 (structure proteomics),功能蛋白质组学 (functional proteomics),1.表达蛋白质组学,研究,细胞,或组织中蛋白质表达的质和量的变化，以及不同时间基因表达谱的改变,2.结构蛋白质组学,以绘制出蛋白复合物的结构或存在于一个特殊细胞器中的蛋白为研究目的，用于建立细胞内信号转导的网络图谱并解释某些特定蛋白的表达对细胞的作用,3.功能蛋白质组学,研究在不同生理和病理条件下，细胞中各种蛋白质之间的相互作用关系及其调控网络，以及蛋白质的转录和修饰,蛋白质组学研究路线,主要技术,1. 双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis,2-DE）,第一向：等电聚焦（IEF），根据蛋白质的等电点进行分离,第二向：SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据蛋白质分子量差异 进行分离,2.,双向荧光差异凝胶电泳（two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis,2D-DIGE）,采用专有的荧光染料与多重样本和图像分析的方法，在同一块胶上可同时分离多个有不同荧光标记的样品，并以荧光标记的样品混合物为内标，对每个蛋白质样品和每个差异都可以进行统计学可信度分析,生物质谱技术,质谱是带电原子、分子或分子碎片按质量的大小顺序排列的图像,质谱仪是一类能使物质离子化并通过适当的电场、磁场将它们按空间位置、时间先后或轨道稳定与否实现质量比分离，并检测强度后进行物质分析的仪器。质谱仪主要由分析系统、电学系统和真空系统组成,基本原理：通过对被测样品离子的,质核比,的测定来进行分析的一种分析方法。被分析的样品首先要,离子化,，然后利用不同离子在电场或磁场的运动行为的不同，把离子按质荷比（m/z）分开而得到质量图谱，通过样品的质量图谱和相关信息，可以得到样品的定性定量结果。,质谱技术的发展,1912,英国物理学家 Thomson研制成功第一台质谱仪,20世纪20年代,质谱成为一种分析手段被化学家所采用,40年代开始,质谱广泛用于有机物质的分析,1966,Munson&Field报道了化学电离源，质谱第一次可以 检测热不稳定的生物分子,80年代,随着,软电离,技术（快原子轰击FAB、电喷雾ESI、基质辅助激光解吸MALDI）的发展，生物质谱得到了飞速发展,软电离,在质谱分析中，离子源是将分子离解成离子或解离成碎片，在这里分子失去电子，生成带正电荷的分子离子。分子离子可进一步裂解生成质量更小的碎片离子。由于离子化所需要的能量随分子不同差异很大，因此，对于不同的分子应选择不同的离解方法。通常称能给样品较大能量的电离方法为硬电离方法，而给样品较小能量的电离方法为软电离方法，后一种方法适用于易破裂或易电离的样品。,“,软,”,是相对于最常用的电子电离EI而言,。采用软电离技术容易获得能指明相对分子质量的准分子离子（M+H）+、（M-H）+，但能提供结构信息的碎片离子较少。,生物质谱的一般结构,质谱仪组成,样品,离子源,形成离子,(,带电分子,),检测,质谱,质量分析器,离子检测器,电离,质量分选,(,过滤,),根据,m/z,分选离子,数据处理,检测离子,基本步骤,:,1.,样品离子化,2.,根据质量,(m/z),不同分离离子,3.,检测每种质量离子的数目,4.,收集、处理数据得到质谱图,生物质谱仪的离子源与质量分析器,离子源,ElectroSpray Ionization(ESI),Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization(MALDI),质量分析器,Time of Flight(TOF),Ion Trap(IT),Quadra poles(Q),Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance(FT-ICR),ESI,借助强电场使电子分离，当样品溶液以低流速经毛细管流出后，在雾化器的辅助下雾化成细小的带点液滴。这些液滴在运动过程中逐渐脱溶剂化导致体积变小，表面电荷密度增大，当达到一定极限时，液滴发生爆裂产生更小的液滴。如此不断重复，直至液滴很小时，由于液滴表面电荷密度极大，足以从液滴中解析出分子离子，而后者最终进入质谱分析器,电喷雾离子化仅能容忍较低容量的缓冲溶液、盐和表面活性剂，这些物质可以和分析物形成化合物从而干扰分子量的测定或抑制分析物离子的形成。HPLC是分离去除污染物的常用手段，而ESI的一大优点就是可以很容易的和HPLC等各种预分离技术相连接。随着20世纪90年代，纳喷雾的出现，ESI-MS灵敏度大大提高，已经可以检测Femtomole(毫微微克分子)和Attomole(10,-18,mole)级的生化样品,DESI(desorption electrospray ionization),该技术的突破在于可以直接在大气压环境下分析未经任何处理的样品，如皮肤、花朵、尿液、生理组织等,DESI直接将电喷雾的带点液滴和溶剂离子射向被分析物表面，就可以使样品表面的分子解吸附并带上电荷被质谱检测。Cooks课题组曾使用DESI技术直接分析人肝腺癌组织样品，成功找到一些特殊磷脂在癌变区域含量异常升高的现象，而这些磷脂的存在正是和人体器官内机能紊乱神经酰胺引导的细胞死亡通路相关联,DART(direct analysis in real time),MALDI,使用基质的目的是为了保护待分析物不会因过强的激光能量导致化合物被破坏,使用特定波长的激光（常用337nm和355nm紫外激光、1.06m红外激光等）照射到样品靶上，样品靶上的基质将吸收到的能量传递给样品，使样品产生瞬间膨胀相变而发生本体解吸，使样品离子化,常规的MALDI源处在真空系统内，不允许MALDI-MS直接在线和其他样品预分离系统联用，也无法直接和其他自动化、机器人处理系统联用，不可避免影响整个MALDI-MS样品检测的高通量性,APMALDI(Atmosphere Pressure),SELDI(Surface Enhanced,TOF 离子在离子源里产生，在电压为V的电场作用下加速，飞过漂移区后到达检测器内，这段飞行时间为其在加速区中飞行时间和漂移区的飞行时间之和，正比于其质量的平方根,IT 离子阱的上下端罩与左右环电极构成可变电场，带电离子在一定轨道上旋转，改变电压可使相同m/z离子依次离开进入电子倍增器而分离,Q 样品离子沿电极间轴向进入电场后，在极性相反的电极间振荡，只有质荷比在某个范围的离子才能通过四级杆到达检测器，其余离子因振幅过大与电极碰撞，放点中和后被抽走,FT-ICR 离子在磁场作用下成为回旋离子，离子回旋时吸收与磁场垂直的电场能量，当离子能量和吸收能量相等时产生共振，此时切断交变电场，回旋离子在电极上产生感应电流，感应电流随时间衰减，记录该信号并通过傅里叶变换将时域图转换为频域图（质谱图）,01,TOF,离子在离子源里产生，在电压为V的电场作用下加速，飞过漂移区后到达检测器内，这段飞行时间为其在加速区中飞行时间和漂移区的飞行时间之和，正比于其质量的平方根,离子阱的上下端罩与左右环电极构成可变电场，带电离子在一定轨道上旋转，改变电压可使相同m/z离子依次离开进入电子倍增器而分离,03,Q,样品离子沿电极间轴向进入电场后，在极性相反的电极间振荡，只有质荷比在某个范围的离子才能通过四级杆到达检测器，其余离子因振幅过大与电极碰撞，放点中和后被抽走,02,IT,0,4,FT-ICR,离子在磁场作用下成为回旋离子，离子回旋时吸收与磁场垂直的电场能量，当离子能量和吸收能量相等时产生共振，此时切断交变电场，回旋离子在电极上产生感应电流，感应电流随时间衰减，记录该信号并通过傅里叶变换将时域图转换为频域图（质谱图）,MALDI-TOF-MS,质谱的分析步骤,2.样本被激光电离形成多肽,离子混合物,Pulsed laser,3.多肽离子在TOF管里飞行，飞行速度取,决于多肽离子的M/Z的大小,1.基质与多肽样本共同,置于刚靶上,5.,检测到每个离子的,M/Z,后，同一张图谱上计算机输出每个肽段,M/Z,，即蛋白质的多肽图谱，通过与理论数据库中的肽图片比对，从而鉴定蛋白,4.,到达检测器的离子，通过检测器检测出每个肽段离子的,M/Z,Tim,e,Flight tube,High vacuum,High voltage,20 - 25 kV,现在生物质谱主要在蛋白质组学研究中承担以下任务：,（1）通过精准的质量分析器来测定蛋白质的准确分子量或检测肽指纹谱,（2）通过CID、CAD、PSD等串级方式对肽段进行序列测定,（3）对蛋白质巯基及二硫键进行定位,（4）对蛋白质翻译后修饰状况进行定位,（5）检测生物分子相互作用及非共价化合物,生物质谱在蛋白质组学研究中的利用,1.蛋白质的定性分析,依据分析对象是整体蛋白质混合物或酶切后的多肽混合物，蛋白质组的定性分析方法分为自下向上法（bottom,up，针对,多肽混合物,）和自上向下法(top,down，针对整体,蛋白质混合物,)。,依据蛋白质数据库中是否存在所鉴定的蛋白质，蛋白质组的定性分析方法进一步分为：对蛋白质数据库中含有待鉴定的蛋白质，包括：肽质量指纹谱法（PMF，适合于简单蛋白质混合物)；肽序列标签法（PST，适合于复杂蛋白质混合物）,。对蛋白质数据库中不存在待鉴定的蛋白质，采用从头测序法（de,novo）,Schematic showing the top-down and bottom-up approaches to protein analysis and identification. In the,top-down approach, the,intact protein is fragmented in the gas-phase to create sequence-specific fragment ions,to aid in sequence analysis. The,bottom-up approach,uses,proteolytic enzymes,to create peptides for sequence analysis usually by using,multidimensional liquid chromagoraphy,in combination with,tandem mass spectrometry,自顶向下策略是以蛋白质分子整体作为分析对象，通过蛋白质的,肽质量指纹,（peptide,mass,fingerprinting,PMF）对蛋白进行鉴定的方法。为了有效地克服质量简并的现象，减少搜索目标的范围，一般选择高精度和高分辨率的质谱，如傅里叶变换离子回旋共振质谱仪（2ppm，50000）。该策略具有较高的序列覆盖度和翻译后修饰特征的保持，适合于翻译后修饰及特殊的蛋白质异构体的分析。不足的是，(1)实验样品蛋白质需要高度纯化；(2)在目前的实验条件下，较难分析大分子量的蛋白质。,自底向上策略,称之为鸟枪法,是利用串联质谱数据，即,肽碎片指纹,（peptide,fragment,fingerprinting，PFF）来鉴定肽段序列，然后再推断组装样品中包含的蛋白质,是常用的高通量分析策略。由于肽碎片携有呈几何增长的组合信息，可以消除质量简并之忧，对质谱的质量分辨率要求不高，多用于对复杂样品的混合物进行高通量分析。,成功鉴定,样品,酶解,酶解片断,一级质谱,PMF,肽指纹图谱,串联质谱,对库,检索,序列数据库,PSMs,及后筛选,De-novo,序列分析,未知蛋白,蛋白质鉴定流程,定性蛋白组学实验平台,2.蛋白质的定量分析,定量蛋白质组学:把一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂体系中的所有蛋白质进行精确地定量和鉴定,原理：对于具有相同离子化能力的蛋白质或多肽可以通过比较质谱峰的强度或峰面积得到待比较蛋白质的相对量,方法,1.直接进行比较，包括SDS-PAGE、2DE、HPLC;,2.标记方法，包括同位素标记亲和标签（ICAT、iTRAQ）、元素标记亲和标签（ECAT）、酶促,18,O标记、DYGE技术和同位素氨基酸细胞培养标记（SILAC),例：iTRQA试剂结合生物质谱用于蛋白质组的相对定量方法,(1)试剂的反应基团（PRG）特异地与肽段的N-端氨基和Lys的-氨基结合；,(2)平衡基团与不同质量的报告基团在一级质谱图上显示为一个峰，为肽段质量数加上144,Da；,(3),在二级质谱图上，报告基团特异性地断裂，其比值即为两样本中蛋白的相对定量,3.蛋白质的翻译后加工,蛋白质的修饰类型主要有磷酸化、糖基化等，其中蛋白质的磷酸化和去磷酸化几乎调节着生命活动的整个过程。蛋白质,磷酸化是增加了HPO,3,基团，可通过增加80u的氨基酸残基质量数来检测,，便可识别蛋白质翻译后修饰信息,用质谱确定蛋白质磷酸化位点有如下方法:,磷酸酯酶处理和MALDI-TOF-MS-PME相结合找出肽段中哪一个肽段被磷酸化了,三级四级杆串联质谱的前体离子扫描技术进行检测,傅里叶变换离子回旋质谱的电子捕获解离技术鉴定肽片段的磷酸化位点,4.蛋白质的相互作用,首先通过生化的方法,纯化蛋白质复合体,，然后用,质谱分析,其组分,用质谱技术研究此类问题主要有两种策略，一是分离获得结合蛋白，再用SDS-PAGE分离，并进行胶内酶切与串联质谱分析；或将混合蛋白质直接酶解，用多位色谱串联质谱进行鉴定,基于质谱的相互作用研究,01,诱饵设置,02,03,相互作用分析,复合物亲和纯化,抗体免疫亲和沉淀,目标蛋白标记标签,