单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,1985,年,美国,PE-cetus,公司人类遗传研究室的,Kary mullis,发明了具有划时代意义的,PCR,技术,1988,年,美国,PE-cetus,公司推出世界上第一台,PCR,热循环仪，从而使,PCR,反应自动化,1993,年,Kary Mullis,因发明,PCR,技术获得诺贝尔化学奖,1995,年,定量,PCR,仪诞生，使定量研究,DNA,靶序列成为现实,PCR,技术的诞生与发展,Kary Mullis,第,1,页,/,共,15,页,PCR反应原理和反应过程,（一）,PCR基本组成：,模板DNA,引物,4种脱氧核糖核苷酸,DNA聚合酶,其他（Mg,2+,、化学物质等）,（二）,DNA的体外复制的步骤：,1、变性,（90-96）,2、退火,（25-65）,3、延伸,（70-75）,每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。,第,2,页,/,共,15,页,、变性（,denaturation,）,双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。,第,3,页,/,共,15,页,2,、复性,(renaturation),（退火，,annealing,）,系统温度降低，引物与DNA模板结 合，形成局部双链。,影响复性速度的因素：,DNA,浓度,DNA,片段的大小,DNA,片段复杂性 合适的复性温度 适当的离子强度,第,4,页,/,共,15,页,3、延伸（extension）,在Taq酶（在72左右，活性最佳）作用下，以dNTP为原料，从5端3端延伸，合成与模板互补的DNA链。,第,5,页,/,共,15,页,常用的荧光定量,PCR,方法,SYBR Green I,Taqman,水解探针,第,6,页,/,共,15,页,SYBR Green I,结合到双链,DNA,的小沟部位,只有与双链,DNA,结合后才发荧光,SYBR,与ds,DNA,结合，并且受到激发的时候，可以发出绿色荧光,第,7,页,/,共,15,页,SYBR Green I,工作原理,未结合的,SYBR green I,第,8,页,/,共,15,页,TaqMan Probes,（探针）,荧光素,淬灭剂,与目标序列互补,FAM,TET,JOE,HEX,VIC,TAMRA,TaqMan,探针的机理,DNA,聚合酶在延伸阶段将探针切碎，使荧光基团和荧光淬灭基团分开，于是荧光得以检测,第,9,页,/,共,15,页,TaqMan Probes,工作原理,光,能量转移,Taq,游离的探针,荧光基团,淬灭剂,延伸时，,Taq,酶水解探针，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离而发出荧光，形成荧光信号,Taq,发出荧光,光,另一波长的荧光,第,10,页,/,共,15,页,第,11,页,/,共,15,页,荧光定量,PCR,与常规,PCR,的区别,常规,PCR,技术,对,PCR,扩增的,终产物,进行定性及定量分析,荧光定量,PCR,技术,实时监测,PCR,扩增反应中,每一个循环的产物,定量分析,第,12,页,/,共,15,页,Ct,与初始模板的关系,固定循环数后，荧光信号与模板数成正比,固定荧光信号值后，模板数就与循环数成反比,初始,DNA,量越多,荧光达到阈值时所需要的循环数,(Ct,值,),越少,起始模板的对数浓度与,Ct,呈线性关系，根据样品的,Ct,值就可计算出样品中所含的模板量,Threshold,10,4,10,3,10,2,第,13,页,/,共,15,页,实时荧光定量,PCR,的特点,特异性强,灵敏度高,可直接对产物进行定量,自动化程度高、操作简单,第,14,页,/,共,15,页,第,15,页,/,共,15,页,