,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四章 药物定量分析与分析方法验证,第一节,定量分析样品的前处理方法,第二节,定量分析方法特点,第三节,药品质量标准分析方法验证,第四节,生物样品分析方法的基本要求,返回主目录,基本要求,练习与思考,基本要求,一、掌握定量分析方法验证的效能指标。,二、熟悉定量分析样品的前处理方法。,三、了解定量分析样品的前处理方法的进展,及在药物分中的应用。,返 回,第一节,定量分析样品的前处理方法,一、概述,1.为什么要对定量分析的样品进行前处理？,含卤素有机药物,R-X（,F，Cl,Br,I）,金属有机药物,R-O-Me（,有机酸或酚的,含金属有机药物 金属盐；结合不牢固）,有机金属药物,R-Me,（,结合牢固）,2.常用的处理方法 不经有机破坏的分析方法,药物分析中常用的分析方法,经有机破坏的分析方法,二、不经有机破坏的分析方法,（一）直接测定法,例如：富马酸亚铁,溶于热稀矿酸，采用铈量法，邻二氮菲作指示剂,（二）经水解后测定法,1.,直接回流后测定法,例如：三氯叔丁醇的含量测定,CCl,3,-C(CH,3,),2,-OH+4NaOH (CH,3,),2,CO+3NaCl+,HCOONa,+2H,2,O,NaCl,+AgNO,3,AgCl,+NaNO,3,AgNO,3,+NH,4,SCN,AgSCN,+NH,4,NO,3,2.,用硫酸水解后测定法,例如：硬脂酸镁的含量测定,Mg(C,17,H,35,COO),2,+H,2,SO,4,MgSO,4,+2C,17,H,35,COOH,H,2,SO,4,+,2NaOH Na,2,SO,4,+2H,2,O,（三,）,经氧化还原后测定法,1.,碱性还原后,测定 例如：泛影酸的含量测定,2.,酸性还原后,测定 例如：碘番酸的含量测定,Zn,还原,后银量法,3.利用药物中可游离的金属离子的氧化性测定含量,（1）含锑药物 例如：葡萄糖酸锑的含量测定,Sb,5+,+2KI Sb,3+,+2K,+,+I,2,I,2,+2Na,2,S,2,O,3,2NaI +Na,2,S,4,O,6,（2）,含铁药物,2Fe,3+,+2KI 2Fe,2+,+2K,+,+I,2,I,2,+2Na,2,S,2,O,3,2NaI +Na,2,S,4,O,6,H,+,三、经有机破坏的分析方法,湿法破坏,药物分析中常用的有机破坏的方法有,干法破坏,HNO,3,-HClO,4,法 氧瓶燃烧法,(一)湿法破坏,HNO,3,-H,2,SO,4,法,H,2,SO,4,-,硫酸盐法,HNO,3,-H,2,SO,4,-HClO,4,法；,H,2,SO,4,-H,2,O,2,；H,2,SO,4,-KMnO,4,(二)干法破坏 加,Na,2,CO,3,或,MgO,以助灰化；温度控制在,420,(三)氧燃瓶燃烧法,(,oxygen flask combustion method),1.,仪器装置 500,ml,1000ml,2000ml,磨口、硬质玻璃锥形瓶,2.称样 固体样；液体样要求详见,P84,3.,燃烧分解操作法,4.吸收液的选择 用于,X、S、Se,等的鉴别、检查、含量测定时,多数是,H,2,O,或,H,2,O-NaOH；,少数为,H,2,O-NaOH-H,2,O,2,.,第二节,定量分析方法特点,一、容量分析法,（一）容量分析法的,特点,操作简单、快速；,比较准确（,RSD0.2%）；,仪器普通易得。,（二）容量分析法的,计算,问题,1.,滴定度,（,T,）,的概念 每1,mlmol,溶液相当于被测物质的量(,mg),2.,滴定度的计算,aA,+,bB,cC,+,dD,T,=,M,b/a,B,3.,百分含量的计算,（1）直接滴定法,D%=,V,F,T/W,100%,F,=,实际标定的浓度/规定的浓度,（2）间接滴定法（回滴定法；剩余滴定法）,D%=（,V,O,V,B,),F,T,/,W,100%,二、光谱分析法,（一）紫外-可见分光光度法（200,nm760nm),灵敏度高，可达10,-4,g/ml,10,-7,g/ml,1.特点 准确度高，,SRD（%）,为2%,5%,仪器价格低廉，操作简单，易普及，应用,范围广。,2.朗伯-比耳定律,A=ECL E,1%,1,cm,=,10/M,3.,对溶剂的要求:,220,240nm 241250nm 251300nm 300nm,以上,溶剂+吸收池,A,0.41 0.20 0.10 0.05,4.,测定方法,要求供试品溶液的,A,应在0.3,0.7,对照品比较法：,C,x,=(,A,x,/,A,r,),C,r,;,含量%=,C,x,D/W,100%,常用方法 吸收系数法：含量%=(,E,1%,1,cm,),x,/(,E,1%,1,cm,),r,100%,计算分光光度法：,V,A,的三点校正法,（二）荧光分光光度法,灵敏度高,，可达10,-10,g/ml,10,-12,g/ml,在,低浓度,进行测定，防止,F,与,C,不成正比及自熄灭作用,1.,特点,用基准物溶液校正仪器灵敏度，防止样品液荧光衰减,灵敏度高，但,干扰因素多,。,制备荧光,衍生物,，可提高其灵敏度和选择性。,用样品,量少,，操作,简单,，方法,快速,，应用,范围,较,广,。,2.荧光分析仪 有二个单色光器激发单色光器与发射单色光,器；且激发光源、样品池和检测器成直角。,3.含量测定 常用的方法对照品比较法:,C,i,=(,R,i,-,R,ib,)/(,R,r,-,R,rb,),C,r,Ch.P,收载,地高辛片、利血平片、洋地黄毒苷片。,三、色谱分析法,按分离原理分为：吸附；分配；离子交换；排阻色谱,方法分类,按分离方法分为：,PC；TLC；,柱色谱；,GC；HPLC。,（一）,HPLC,法,1.对,HPLC,仪器一般要求 色谱柱、流动相按品种项下要求。,色谱柱的理论板数：,n,=5.54(,t,R,/,W,h/2,),2,2.系统性试验 分离度：,R,=2（,t,R1,t,R2,)/(,W,1,+,W,2,);,要大于1.5,拖尾因子：,T,=,W,0.05h,/2,d,1,应在0.9,1.05,内标法加校正因子测定供试品中主成分含量,3.测定方法,标准曲线法,外标法测定供试品中主成分含量,外标一点法,应用示例：,RP-HPLC,法测定盐酸黄酮哌酯片含量，用标准曲线法,如头孢拉丁；头孢羟氨苄；头孢唑啉钠用外标一点法,（二）,GC,法,1.对,GC,仪器一般要求,载气为,氮气,；色谱柱为填充或毛细管柱,色谱柱的理论板数：,n,=5.54(,t,R,/,W,h/2,),2,2.系统性试验 分离度：,R,=2（,t,R1,t,R2,)/(,W,1,+,W,2,);,要大于1.5,拖尾因子：,T,=,W,0.05h,/2,d,1,应在0.9,1.05,内标法加校正因子测定供试品中主成分含量,3.测定方法,标准曲线法,外标法测定供试品中主成分含量,外标一点法,应用示例：,Ch.P(2000),收载的月桂卓酮、维生素,E,及其片剂、注,射剂、甲酚皂溶液等均采用,GC,法中的内标法加校正,因子测定含量。,返 回,第三节,药品质量标准分析方法验证,一、准确度,是指用该方法,测定结果与真实值接近的程度,，用,回收率,表示,（一）含量测定方法的准确度,1.原料药 可用已知纯度对照品或样品进行测定；或与已建准确,度的另一方法测定的结果进行比较。,2.制剂 要考察,辅料对回收率的影响,。采用在空白辅料中加入原,料对照品的方法作回收率试验，然后计算,RSD,。,具体做法：测定高、中、低三个浓度，,n=3,共9个数据来评价,回收率的,RSD,2%,；,用,UV,和,HPLC,法时，一般回,收率可达98%102%；容量法可达99.7%100.3%,（二）数据要求,回收率%=（测定平均值 空白值）/加入量100%,要求制备,高,、,中,、,低,三浓度的样品，各测定,3次,。应,报告已知加入量的回收率，或测定结果平均值与真实值,之差及其可信限。,二、精密度,是指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次测定结果,之间的,接近程度,。,（一）精密度表示方法,1.,偏差,(,deviation,d,),d,=,测得值-平均值=,X,i,-,X,2.,标准偏差,（,standard deviation,SD,或,S,）,S,=(,X,i,X,),2,/(n-1),1/2,3.,相对标准差,(,relative standard deviation,RSD,),也称变异系数,(,coefficient of variation,CV,),RSD=,标准偏差/平均值100%=,S/X,100%,（二）重复性、中间精密度及重现性,1.,重复性,在相同条件下,由一个分析人员测定所得结果的精密度.,2.,中间精密度,在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不,同设备测定结果的精密度。,3.,重现性,在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度。,（三）数据要求,应报告,S,或,SD、RSD,和置信区间。用统计学的可信性分析(,t,或,f）。,三、专属性,是指在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等)可能存在下，,采用的方法能准确测定出被测物的特性。鉴别反应、杂质检,查、含量测定方法，均应考察其专属性。,。,四、检测限（,limit of detection,LOD,),是指试样中被测物能被检测出的,最低浓度或量,，是限度检验,指标。它无需测定，只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可。,（一）,常用的方法,1.,非仪器分析目视法,用已知浓度被测物，试验出能被可靠地,检测出的最低浓度或量。,2.,仪器分析方法,UV,法：,LOD,=,f,.3,S,空,=,C,样,/,A,样,3,S,空,Flu,法：,LOD,=,f,.3,S,空,=,C,样,/(,F,样,-,F,空,),3,S,空,GC,和,HPLC,法：,LOD,=,S,/,N,=2,或3,（二）数据要求,应附测试图，说明测试过程和检测限结果。,五、定量限（,limit of,quantitation,LOQ,),是指样品中,被测物能被,定量测定,的最低量,，其测定结果应,具一定准确度和精密度。杂质和降解产物进行定量测定时，要求,LOQ,.,常用信噪比法确定定量限，一般以,S/N=10,时相应的浓度进行,测定。,六、线性,是指在设定的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接,呈,正比,关系的,程度,。,UV,法：首先制备一个标准系列，浓度点,n=5;A=0.3.0.7,建立回归方程,C=,aA,+b;,r 0.9999,。,HPLC,法：制备一个标准系列，浓度点,n=5 7;,以,C,对,h,或,A,或与,内标物的峰面积之比，建立回归方程,r 0.9999,。,七、范围,是指达到一定精密度、准确度和线性、测试方法,适用的高低限度或量的区间,。,原料药和制剂含量测定,：范围应为测试浓度的,80%-,120%,。,制剂含量均匀度检查,：范围应为测试浓度的,70%-,130%,。,溶出度或释放度中的溶出量测定,：范围应为限度的,20%,。,八、耐用性,是指在测定条件下有效的变动时，测定结果不受影响的,承受,程度,。典型的变动因素有：被溶液的稳定性、样品提取次数、时,间等。,HPLC,法变动因素有：流动相组成与,pH，,色谱柱，柱温，流速等。,GC,法变动因素有：色谱柱，固定相，担体、柱温、进样口和检,测器温度等。,分析方法效能指标的具体应用,：,1.用于鉴别试验的方法：只要求专属性、耐用性，其余不要求。,2.,用于原料药中杂质测定和制剂中降解产物测定的方法：,用于定量：除了检测限不要求外，其余七项指标均要求。,限度检查：除检测限、专属性、耐用性要求外，其余不要求。,3.原料、制剂及溶出度测定：不要求检测和定量限，其余均要求。,返 回,第四节,生物样品分析方法的基本要求,一、常用样品的种类、采集和贮张,二、生物样品分析前处理技术,三、定量分析方法