,细胞重组（又叫细胞拆合）,是指从活细胞中分离出细胞器及其组分，然后体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组装配成为具有生物活性的细胞或细胞器的一种实验技术,8.1.1,特点和意义,8.1.2,细胞重组技术,8.1,细胞重组,8.1.1,特点和意义,真核生物的细胞核与细胞质相互配套、精确平衡，但细胞核的作用显的较为突出,细胞生长的过程就是一个在活体内自我装配的过程,细胞重组技术是一种体外装配技术，需要细胞分离技术与细胞融合技术结合使用,8.1.2,细胞重组技术,细胞重组技术的基本形式：,胞质体与完整细胞重组形成胞质杂种,微细胞与完整细胞重组形成微细胞异核体,胞质体与核体重新组合形成重组细胞,8.1.2,细胞重组技术,8.1.2.1,显微操纵术,8.1.2.2,细胞分离技术,8.1.2.3,细胞破碎方法,8.1.2.4,细胞器的分离,8.1.2.5,胞质体、核体和微细胞的制备,8.1.2.6,细胞器拆合重组举例,8.1.2.1,显微操纵术,显微操纵术,需要借助专门的细胞操作仪，用微细玻璃针或用微吸管、微电极、微热电偶等斜插入细胞中去可以将细胞核挑出来造就去核细胞，也可以进一步作移核实验与电生理实验，还可以进行各部分物质的抽取和移植各种物质的注入，测量微电位的变化等。,8.1.2.2,细胞分离技术,根据细胞性质选择合适的分离方法,细胞大小,细胞密度,细胞表面电荷,细胞中一个或多个成分的荧光强弱,细胞对其他介质的吸附作用,8.1.2.2,细胞分离技术,可选用的方法：,梯度沉降分离法：根据细胞大小不同分离细胞,等密度沉降分离法：根据细胞密度差异来分离细胞,流式细胞仪分离法：细胞表面标志,8.1.2.3,细胞破碎方法,超声波破碎法,反复冻融法,化学裂解法,高速组织捣碎法,8.1.2.5,胞质体、核体和微细胞的制备,细胞松弛素,B,处理体外培养细胞能诱发培养细胞排核，结合高速离心就可得到胞质体,核体为与胞质分离得到的细胞核，带有少量胞质并围有质膜，称为“核体”,制备微细胞需首先用秋水仙素处理细胞可得微细胞,8.1.2.6,细胞器拆合重组举例,叶绿体与线粒体是研究较多的移植材料,叶绿体的移植方法,：将分离纯化的叶绿体与原生质体一道培养，通过细胞的胞饮作用将叶绿体摄入原生质体，经过培养，原生质体再育成完整的植株。,线粒体的移植方法,较多，有微注射法、载体转移法以及胞饮摄入等。,8.2,克隆技术,8.2.1,克隆的定义,8.2.2,克隆的相关理论基础,8.2.3,克隆的技术方法,8.2.4,克隆技术的应用与意义,8.2.5,正确看待克隆技术,8.2.6,克隆动物的现状和发展趋势,8.2.1,克隆的定义,克隆（,clone),一词源于希腊语,clonos,，,原意,指用于扦插的枝条,twig,，也就是无性繁殖,本意,指遗传上完全相同的分子，细胞或来自于同一祖先的生物个体的无性繁殖群体,外延的含义,：,1,、核移植操作可以得到重组细胞，重组细胞可以繁殖成一个无性系；,2,、基因工程可将特定基因拼接到质粒的复制子上随复制子的复制，也能得到,DNA,的无性系,本章专指核移植技术得到无性系动物,8.2.2,克隆的相关理论基础,细胞的全能性与细胞机能特化两者之间是相互矛盾的。,单细胞微生物具有全能性,，而,高等生物细胞有了机能特化趋势,植物细胞具有全能性而动物发育过程中分化了的细胞不能再产生完整的个体，因为分化细胞的基本组发生了不可逆的修饰。,Spemann,提出了“,分化了的细胞核移入卵子中能否指导胚胎发育,”这样的设想。,8.2.3,克隆的技术方法,8.2.3.1,细胞核移植,8.2.3.2,核移植技术,8.2.3.3,克隆动物一般制备技术,8.2.3.4,体细胞克隆技术,8.2.3.1,细胞核移植,细胞核移植技术,是一种利用显微镜操作技术将一种动物的细胞核移入同种或异种动物的去核成熟卵内的精细技术,根据核供体可分为,胚胎细胞核移植与体细胞核移植,理论基础,：生物的主要遗传物质存在于细胞核中，因此核移植的受体将具有与核移植供体完全相同的遗传基础。,8.2.3.1,细胞核移植,Spemann,提出设想但由于技术限制没有将细胞核移入卵子。,1952,年美国两位科学家利用两栖类卵细胞建立了细胞核移植技术，并于,1955,年培育出成体豹蛙,1958,到,1962,年利用细胞核移植技术得到,非洲爪蟾,1961,年童弟周教授以金鱼为材料进行鱼类不同亚科间细胞核移植成功。,1989,年利用核移植技术无性繁殖了,鲤鲫核鱼,新品种。,8.2.3.2,核移植技术,细胞核移植要求供体细胞与受体细胞处于,相同的细胞周期,，实验中利用的细胞分裂同步化的方法为“,饥饿法,”。,1,、供体和受体的准备,2,、去卵膜和卵核,3,、供体细胞制备,4,、移核,8.2.3.3,克隆动物一般制备技术,不同来源的细胞核都可用作核供体如胚胎细胞、干细胞、成纤维细胞和体细胞，其中胚胎细胞的应用比较普遍，体细胞克隆意义最大。,1,、,胚胎细胞核移植,：将未着床的早期胚胎分散成单个细胞，然后利用细胞融合技术进行核移植。,2,、胚胎干细胞核移植：先培养胚胎干细胞系，再进行核移植。,3,、胎儿成纤维细胞核移植：从早期胚儿分离出胎儿成纤维细胞用于核移植。,8.2.3.4,体细胞克隆技术,体细胞克隆技术,是将动物体细胞经过抑制培养，使其处于休眠状态，利用细胞核移植技术将其导入去核卵母细胞，发育成胚胎后移植至受体，妊娠产仔，克隆出成体动物。,体细胞克隆羊“,Dolly”,是于,1997,年,2,月,23,日由英国爱丁堡罗斯林研究所和,PPL,制药公司的胚胎学家伊恩,.,维尔穆特博士的研究小组克隆出一只雌性小绵羊。,2003,年,2,月,14,日多利因患严重肺病罗斯林研究所人员不忍视其痛苦的等特死亡，无奈之下施以安乐死。共存活,6,年，其间于,1998,年与威尔士山羊交配自然怀胎产下一小羊“邦尼”。,(,普里姆,塞恩,Prim Singh,),维尔穆特表示不会接受克隆羊的最初设想出自亚洲人的头脑。,8.2.4,克隆技术的应用与意义,1,、检验动物细胞全能性,2,、加速动物繁殖，优良育种，保护珍贵动物,3,、医药领域解决人体器官异体移植问题,8.2.5,正确看特克隆技术,8.2.6,克隆动物的现状和发展趋势,胚胎细胞核移植培育克隆鼠的过程,多莉,多莉,多莉与邦尼,Dolly,标本与,Ian Wilmut,Prim Singh,鱼核移植,2.7kg/5months and 7.4kg/17months,快速生长的鲤鲫核鱼,据俄罗斯新闻网,2005,年,10,月,29,日报道，意大利克雷莫纳繁殖技术研究中心克隆技术专家组组长切萨雷,加利教授介绍说，该中心还是首次一次性成功地克隆出如此多的哺乳类动物。目前，小猪仔们的健康状况良好。加利教授认为，克隆猪技术的成果对医学界非常有研究价值，它有助于医学工作者们进一步探索将动物内脏移植到人体的可能性。,意大利著名的克雷莫纳繁殖技术研究中心又报出喜讯，该中心的科学家们在,2,年前克隆出世界上第一匹马后，日前又一次性成功地克隆出了,14,只小猪仔。,报道说，,2003,年，世界上第一匹克隆马就诞生于意大利克雷莫纳繁殖技术研究中心，此外该中心还成功地克隆过奶牛。目前，克隆猪技术是欧盟最重要的生物技术开发工程之一，欧洲生物科学家希望通过克隆猪来更好地研究哺乳类动物干细胞的克隆方法。,