单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验八,质粒提取与电泳,Extraction and Identification of Recombinant Plasmid,刘向华,南京医科大学 生化与分子生物学系,Nanjing medical university Department of biochemistry and molecular biology,实验八刘向华,1,实 验 目 的,1、学习碱裂解法提取质粒的原理,2、学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法,3、掌握质粒提取及鉴定的基本操作,实 验 目 的1、学习碱裂解法提取质粒的原理,2,实 验 原 理,质粒(Plasmid),是细菌染色体外的遗传物质，为环形闭合的双股DNA。,质粒具有可自主复制、传给子代、也可丢失及在细菌之间转移等特性，与细菌的遗传变异有关。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。,实 验 原 理质粒(Plasmid),3,DNA琼脂糖凝胶电泳：,电荷效应与分子筛效应,核酸从负极向正极泳动，小分子泳动速度较快,质粒DNA较染色体DNA小，且具有超螺旋共价闭合环状的特点。,pH调至中性，变性的质粒DNA恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，与蛋白质一起沉淀。,碱变性条件下,染色体DNA双螺旋解开而变性，而质粒DNA部分解开,双链不会完全分离。,DNA琼脂糖凝胶电泳：质粒DNA较染色体DN,4,实 验 步 骤,取1.5ml菌液，9000rpm离心30秒，尽可能的倒干上清。,用250,l溶液P1重悬菌体沉淀，枪头反复抽吸至菌体,彻底,悬浮。,P1：葡萄糖：制造低渗环境，增加细菌细胞膜的通透性；,增加溶液的粘稠度，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉底。,EDTA：螯合核酸酶,加250,l溶液P2，,温和地,上下翻转10次使菌体充分裂解至清亮。,P2：NaOH/SDS溶液，是最佳的溶解细胞的试剂。,NaOH使DNA变性，SDS使蛋白质变性。染色体与蛋白质缠绕。,加400,l溶液P3，立即,温和地,上下翻转10次，放置5min。13000rpm离心10min，小心取上清。,P3：醋酸/醋酸钾溶液，使溶液pH值恢复接近中性。此时质粒DNA复性，而染色体DNA难以复性。SDS遇到K,+,变成十二烷基硫酸钾，不溶于水，,连同结合的蛋白质和缠绕其上的染色体DNA共同沉淀。,实 验 步 骤取1.5ml菌液，9000rpm离心30秒，尽,5,加500,l去蛋白液PE，13000rpm离心60sec，弃滤液。,加500,l漂洗液WB，13000rpm离心60sec，弃滤液。,（重复一遍）,取出吸附柱，放入干净离心管中，在吸附膜中间部位加40,l,洗脱缓冲液EB，放置1min，13000rpm离心1min洗脱DNA，,-20保存。,空柱13000rpm离心2min。敞口放置3min，除去残留乙醇。,将,上清液,加入吸附柱中，13000rpm离心1min，弃滤液。,注意：吸附柱使用前需先处理。将吸附柱置于收集管上，,加500,l溶液P4，13000rpm离心1min，弃滤液。,P4：缓冲液，湿润、平衡吸附膜,加500l去蛋白液PE，13000rpm离心60sec，弃,6,加250,l溶液P2，,温和地,上下翻转610次使菌体充分裂解，至溶液变清亮。,取1.5ml菌液，9000rpm离心30秒，尽可能的倒干上清。,用250,l溶液P1重悬菌体沉淀，枪头反复抽吸至菌体,彻底,悬浮。,加400,l溶液P3，立即,温和地,上下翻转610次，放置5min。13000rpm离心10min，小心取上清。,吸附柱置于收集管上，加500,l溶液P4，13000rpm离心1min，弃滤液。,加500,l去蛋白液PE，13000rpm离心3060sec，弃滤液。,加500,l漂洗液WB，13000rpm离心3060sec，弃滤液。（重复一次）,取出吸附柱，放入干净离心管中，在吸附膜中间部位加40,l洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在6570水浴中加热效果更好），放置1min，13000rpm离心1min洗脱DNA，-20保存。,空柱13000rpm离心2min。放置35min，除去残留乙醇。,将,上清液,加入吸附柱中，13000rpm离心1min，弃滤液。,加250l溶液P2，温和地上下翻转610次使菌体充分裂解,7,琼脂糖凝胶电泳,样品：10,l质粒样品+2,l上样缓冲液，混匀,电泳：90120mA，电泳2040分钟,配胶：琼脂糖凝胶粉，溶于TBE缓冲液中，,配成1%1.2%的琼脂糖凝胶,上样：将样品用微量移液器加入凝胶孔中,琼脂糖凝胶电泳样品：10 l质粒样品+2 l上样缓冲,8,2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp,Marker,P,EP,实 验 结 果,2000bp 1000bp750bp500bp250bp10,9,负极,正极,负极正极,10,注 意 事 项,1、注意无菌操作，避免细菌污染质粒；,2、琼脂糖凝胶的配制、使用过程中用到溴化乙锭(EB),是,强诱变剂,，具有高致癌性，注意自我防护；,3、所有接触到琼脂糖凝胶的器械均须专用；,4、制备质粒过程中，操作必须缓和，不可剧烈荡，,避免机械剪切力对DNA的断裂作用。,注 意 事 项1、注意无菌操作，避免细菌污染质粒；,11,超净工作台,超净工作台,12,开始实验,开始实验,13,