单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制,不会有代谢产物的积累,解除或突破微生物的代谢调节控制,目的产物积累,微生物育种的目的,方法：突变、体内重组,体外重组（基因工程）,4、工业微生物育种,1,4.1从自然界中获得新菌种,微生物资源分布,土壤、水、空气、动植物及其腐败残骸都是微生物的主要栖居和生长繁殖场所,分离微生物新种的步骤,采样、增殖、纯化和性能测定等步骤。,2,典型的微生物采样和筛选方法,3,直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株。往往低产甚至不产所需的产物，只有经过进一步的人工改造才能真正用于工业生产,菌种选育,突变、体内重组,体外重组（基因工程）,4,4.2 诱变育种,化学诱变,物理诱变,紫外线,5-溴尿密啶,4.2.1 紫外线诱变,造成DNA链的断裂，或使DNA分子内或分子之间发生交联反应,机理,5,交联是由二聚体引起的，二聚体可以在同一条链相邻的碱基之间产生，也可以是在二条链的碱基之间形成。,研究的比较清楚,引起DNA复制错误,嘧啶比嘌呤对紫外线敏感得多,胸腺嘧啶二聚体,6,嘧啶的紫外线光化产物,7,诱变过程中需要注意,光复活作用,微生物等生物的细胞内存在光复活酶,光复活酶识别胸腺嘧啶二聚体，并与之结合形成复合物,打开二聚体，将DNA复原。,可见光光能（300-500nm）激活光复活酶,此时的光复活酶没有活性,8,PRE为光复活酶,9,暗修复,细胞内还存在另一种修复体系，它不需要光激活,可修复由紫外线、射线和烷化剂等对DNA造成的损伤。,暗修复体系有四种酶参与反应。,10,核酸内切酶切开二聚体的5末端,形成3-OH和5-P的单链缺口,核酸外切酶从5-P到3-OH方向切除二聚体，并扩大缺口,DNA聚合酶以另一条互补链为模板，从原有链上暴露的3-OH 端起合成缺失片段,连接酶将新合成链的3-OH与原链的5-P相连接,11,紫外诱变的特点,方便、诱变效果很好的常用诱变剂,在红光下操作或暗培养,参数：紫外灯功率、工作距离、照射时间,12,4.2.2 5-溴尿嘧啶诱变碱基类似物,机理：,与碱基的结构类似，在DNA复制时，它们可以被错误地掺入DNA，引起诱变效应,酮式的5-BU结构与胸腺嘧啶相似，与A配对,5-BU很容易进行酮式与烯醇式结构的互变异构,烯醇式5-BU不与A而与G配对,A：T,G：C,参数：浓度、时间、缓冲液,13,诱变育种的基本过程如下：,在诱变处理前，一般应预先做诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。,合适诱变剂量的选择,14,出发菌株的选择,一是考虑出发菌株是否具有特定生产性状的能力或潜力，即菌株是否具有产生特定代谢产物的催化酶系的基因。,自然界直接分离到的野生型菌株,经历过生产条件考验的菌株,已经历多次育种处理的菌株,菌株来源,其次是出发菌株最好已具备一些有利的性状，如生长速度快、营养要求低和产孢子早而多的菌株。,15,制备菌悬液,待处理的菌悬液应考虑微生物的生理状态、悬液的均一性和环境条件。,一般要求菌体处于对数生长期，并采取一定的措施促使细胞处于同步生长。,悬液的均一性可保证诱变剂与每个细胞机会均等并充分地接触，避免出现不纯的菌落，给后续的筛选工作造成困难。,用玻璃珠振荡打散细胞团，再用脱脂棉花或滤纸过滤，得到分散的菌体。,产孢子或芽孢的微生物最好采用其孢子或芽孢,16,菌悬液的细胞浓度一般控制为：,真菌孢子或酵母细胞10,6,10,7,个/ml，放线菌或细菌10,8,个/ml。菌悬液一般用生理盐水（0.85%NaCl）稀释。,诱变处理,在诱变处理前，一般应预先做诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。,合适诱变剂量的选择,就一般微生物而言，突变率随剂量的增大而增高，但达到一定剂量后，再加大剂量反而会使突变率下降。致死率在70%-80%,17,诱变育种中还常常采取诱变剂复合处理，使它们产生协同效应。,18,4.2.2 菌种筛选的策略,筛选的手段必需配合不同筛选阶段的要求,初筛：要力求快速、简便,复筛：应该做到精确，测得的数据要能够反映将来的生产水平,(1)从菌体形态变异分析初筛,有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性，在筛选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。,19,平皿快速检测法,平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的“形态”变化。,纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等。定性或半定量用，大大提高筛选的效率 初筛,20,微生物特异性平板检测方法,21,饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片变色圈,指示剂直接掺入或喷洒固体培养基，菌落周围形成变色圈。如淀粉的平皿上喷上稀碘液,固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成不透明的培养基背景。菌落利用此物质形成透明圈。,利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌，如待筛选菌具有该营养物的前体转化成营养物 能力，工具菌就能围绕该菌生长,待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制工具菌生长的物质,22,摇瓶培养法,摇瓶培养法是将待测菌株的单菌落分别接种到三角瓶培养液中，振荡培养，然后，再对培养液进行分析测定。,特殊变异菌的筛选方法,营养缺陷型突变株,抗阻遏和抗反馈突变型,抗生素抗性突变株,条件抗性突变,23,营养缺陷型突变株,浓缩、进一步检出和鉴别营养缺陷型等步骤。,筛选步骤：,浓缩营养缺陷型菌株,常用的浓缩方法有抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。,目的：淘汰大量野生型，使营养缺陷型占的比例增加,24,进一步检出所需缺陷型,逐个检出法,影印培养法,25,一般从菌落大小也可以判断，新长出的菌落较小，即是营养缺陷型,夹层培养法,营养缺陷型的鉴定,获得的营养缺陷型菌株还应进一步确认其生长的所需物。,生长谱法,组合补充培养基法,26,营养缺陷型的应用,利用营养缺陷型突变株来生产氨基酸和核苷酸是典型的例子,27,天冬氨酸激酶(AK)被赖氨酸及苏氨酸协同反馈所抑制,通过诱变处理，获得高丝氨酸缺陷型突变菌株，该突变型不能产生苏氨酸。,在限量高丝氨酸的培养基中缺陷型菌株能够正常生长，并且因为消除了反馈抑制,突变型能过量生产L-赖氨酸,28,抗阻遏和抗反馈突变型,抗阻遏和抗反馈突变型都是由于代谢失调所造成的，在细胞中已经有大量最终代谢产物时仍然继续不断地合成这一产物。,选育结构类似物抗性突变株,结构类似物是指一些和细菌体内氨基酸、嘌呤、维生素等代谢产物结构相类似的物质,主要用于末端产物的积累,29,抗性突变菌株的筛选,抗生素抗性突变株,在抗生素产生菌选育中，通过筛选抗生素抗性突变可提高抗生素产量。,抗生素抗性突变株除能提高抗生素的产量外，还能提高其它代谢产物的量。,条件抗性突变,因环境不同，能表现为,野生型,菌株的特性和突变型菌株特性的突变称为条件抗性突变或称为条件致死突变。,温度敏感突变常用于提高代谢产物产量,致死,营养缺陷,30,抗性突变菌株的筛选方法,一次性筛选法,一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致死的环境中，一次性筛选出少量抗性变异株。,噬菌体抗性菌株,耐高温菌株,31,阶梯性筛选法,梯度平板法,32,纸片扩散法,用打孔器将较厚的滤纸（如新华六号）打成小圆片，并使纸片吸收一定浓度的药物，经干燥或不经干燥，放入涂布了菌悬液的平板上，一般9厘米的培养皿中等距放置三片为宜。经培养后观察围绕纸片的抑菌圈，抑菌圈内出现的可能就是抗性菌。,组成酶变异株的筛选,诱导酶的生产需要诱导物，而且受到诱导物的种类、数量以及分解产物的影响。能迅速利用的碳源（如葡萄糖）会引起酶合成的减少，诱导物有时又比较昂贵。,生产成本提高,33,控制酶合成的调节基因发生了变异,诱导酶转变成组成型酶,具体的筛选方法有恒化器法、循环培养法和诱导抑制物法,恒化器法：恒化器常被用于微生物的“驯化”，添加不能起诱导作用的低浓度底物，缓慢生长,循环培养法：利用不含诱导物的培养环境和含有诱导物的培养环境进行交替循环培养待分离的菌悬液，从而使组成酶变异株得到富集。,诱导抑制剂法：加入诱导抑制剂如,-,硝基苯基,-,-,岩藻糖苷阻止某些诱导酶的合成,34,4.3 体内基因重组育种,接合、转化、转导和原生质体融合等遗传学方法和技术使微生物细胞内发生基因重组,4.3.1.原生质体融合,将遗传性状不同的两种菌(包括种间、种内及属间)融合为一个新细胞的技术。,选择亲株,、,原生质体的制备、原生质体的融合、原生质体再生和融合子选择等步骤,步骤,35,微生物原生质体融合的一般原理和过程,36,选择亲株,选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株,为了能明确检测到融合子，参与融合的亲株一般都需要带有可以识别的遗传标记，如营养缺陷型或抗药性等,原生质体制备,去除细胞壁是制备原生质体的关键,37,革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖组成,溶菌酶,微球菌、枯草杆菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌,革兰氏阴性菌不能直接溶壁，只有当乙二胺四乙酸（,EDTA,）,存在时，某些革兰氏阴性菌的细胞壁才能够被溶菌酶溶解。,金黄色葡萄球菌,溶菌酶不能溶解,表皮葡萄球菌能产生一种内肽酶葡萄球菌素，溶解,38,放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌也可采用溶菌酶,真菌细胞壁主要由纤维素、几丁质和葡聚糖等组成,青霉菌多用纤维素酶和,-1,3-糖苷酶等溶壁,曲霉用,-1,3-糖苷酶和,-1,4-糖苷酶等,酵母菌细胞壁中的葡聚糖和几丁质,蜗牛酶,39,培养基中添加甘氨酸，可以使菌体较容易被酶解,在菌体生长阶段添加蔗糖也能提高细胞壁对溶菌酶的敏感性,在菌体生长对数期加入适量青霉素，就能使细胞对溶菌酶更敏感,菌龄：对数生长中期细胞的细胞壁中肽聚糖含量很低，对溶菌酶敏感。,原生质体制备的其他因素：,一般是将原生质体放在高渗的环境中以维持它的稳定性,40,原生质体融合,聚乙二醇（,PEG,）,能有效地促进原生质体融合,一般,PEG,的使用浓度范围在,25-40%,采用电融合仪：在高频电场下，用直流电穿孔来进行融合,原生质体再生,使原生质体重新长出细胞壁，恢复完整的细胞形态结构,41,不同微生物的原生质体的最适再生条件不同，最重要的一个共同点是都需要高渗透压,再生率,细菌为3-10%,真菌在20-80%,融合重组子的筛选,通过两亲株遗传标记的互补而得以识别,两亲株的遗传标记分别为营养缺陷型A+B-和A-B+，融合重组子应是A+B+或A-B-,42,重组子的检出方法有两种：,直接法,将融合液涂布在不补充亲株生长需要的生长因子的高渗再生培养基平板上，直接筛选出原养型重组子,间接法,把融合液涂布在营养丰富的高渗再生平板上，使亲株和重组子都再生成菌落，然后用影印法将它们复制到选择培养基上检出重组子。,43,融合重组的频率=,融合重组子,两亲株原生质体再生菌落的总数,4.3.2 杂交育种,进行体内基因重组育种的其它方法包括接合、转化、转导等,许多重要的具生产价值的微生物的杂交、有性世代等尚未揭示,妨碍了杂交育种手段的实际应用,44,4.3.3、基因工程,这是一种自觉的、能象工程一样事先设计和控制的育种技术，可以完成超远缘杂交，是最新最有前途的育种方法。,45,基因工程的应用仍有很大的局限性：,基因工程产品主要还是一些较短的多肽和小分子蛋白质,蛋白质类以外的发酵产物（如糖类、有机酸、核苷酸及次级代谢产物）产生往往受到多个基因的控制，尤其是还有许多发酵产物的代谢途径还没有被确证,基因工程（包括代谢工程）还难以完全取代传统的菌种选育方法,46,4、DNA Shuffling技术,基本原理,来源不同但功能相同的一组同源基因,用DNA核酸酶I进行消化,产生随机小片段并组成文库,互为引物和模板，进行PCR扩增，,引起模板转换，重组因而发生,导入体内后,选择正突变体作新一轮的体外重组,47,基本步骤,(1)用DNase I消化功能相同的一组基因片段(A)，从而产生随机小片段(B)。,(2)经提纯后，用无引物(经变性后可互为引物)的类似PCR反应重新装配这些小