单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,碱性磷酸酶Km值的测定,1,【,实验目的,】,1.了解酶的Km值测定原理和方法,2掌握碱性磷酸酶AKP活性测定的原理和方法,2,【实验原理】,在温度，PH及酶浓度恒定的条件下，酶促反响的初速度随底物浓度S增大而增加，但当底物浓度增大到一定极限时，那么反响速度趋于恒定，此最大反响速度Vmax，反响速度与底物浓度之间的关系可用米氏方程来表示，即：,3,VmaxS,V=,Km+S,其中Km为米氏常数，,Vmax为最大反响速度，,当V=Vmax/2时，那么Km=s。,Km是酶的特征常数，测定Km是研究酶的一种方法,4,将米氏方程变形为双倒数方程，以l/v1s作图，将各点连线，在横轴截距为-km，据此可算出Km值。,1/V=Km/VmaxS +1/Vmax,5,本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其底物，生成酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4一氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌的衍生物，根据红色的深浅可测出酶活力上下。其反响式如下：,磷酸苯二钠+H2O AKP OH-苯酚,苯酚+4-氨基安替比林K3Fe(CN)6 醌衍生物,红色,6,管 号,1 2 3 4 5 6 7 8,底物液,(0.04M),碳酸缓液(pH=10),蒸馏水,0.05 0.15 0.25 0.30 0.40 0.60 0.80 0.00,0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90,0.95 0.85 0.75 0.70 0.60 0.40 0.20 1.00,混匀后37水浴，预温5分钟左右,【,实验操作,】,7,酶液,0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1,参加酶液后立即混匀保持37水浴，反响开始。,从参加酶液起计时至下一步 参加碱性溶液停止反响，各管反响时间应准确一致，为15分钟。,8,碱性溶液,1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0,4-氨基安,替比林,铁氰化钾,1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0,2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0,混匀，室温放置10分钟左右,以8号管为空白，于5l0nm比色，记录各管的光密度,9,结果记录,1 2 3 4 5 6 7 8,OD,底物浓度 mmol/L,1 3 5 6 8 12 16 0,1/S,1/OD,1 0.333 0.200 0.167 0.125 0.083 0.063 -,【,实验结果,】,1、原始数据,10,2、作图,以 s为横轴，OD510为纵横作图，观察曲线形状；查Km 值,以1s为横轴，1OD510为纵轴作图，观察曲线形状；查Km 值,比较两个值的差异.,11,12,S,1,/,2VMAX,OD510,V,MAX,Km,底物浓度与反响速度关系曲线,双倒数曲线,1/s,1/OD510,-1/Km,1/Vmax,13,比较两个值的大小,分析实验误差产生的原因,比较两种Km测定方法各自的优缺点,【,实验讨论,】,14,