单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,微生物检验技术基础知识,微生物检验技术基础知识,第1页,目 录,一、,微生物基础介绍,二、,培养基,三、,菌种,四、,微生物程度检验法,微生物检验技术基础知识,第2页,一、微生物基础介绍,1,、微生物定义,微生物是一些形体微小，以单细胞或简单多细胞、甚至是没有细胞结构形式存在低等生物统称。,2,、微生物分类,微生物主要分类单位：域、界、门、纲、目、科、属、种、变种、亚种（小种）、型、菌株（品系）,“种”,是最本分类单位，例：大肠埃希菌,微生物检验技术基础知识,第3页,一、微生物基础介绍,3,、微生物特点,体形微小；,结构简单；,生长繁殖快；,种类繁多，分布广，适应性强。,包含：细菌、酵母菌、霉菌、放线菌、立克次氏体、支原体和病毒等。,微生物检验技术基础知识,第4页,一、微生物基础介绍,4,、微生物形态结构,4.1,细菌,4.2,真菌（包含酵母菌和霉菌）,微生物检验技术基础知识,第5页,一、微生物基础介绍,5,、微生物与咱们,每张人民币带细菌：,900,万个；,人体体表及体内存在大量微生物；,皮肤表面：平均,10,万个细菌,/,平方厘米；,口腔“细菌种类超出,500,种；,肠道：微生物总量达,100,万亿；,微生物检验技术基础知识,第6页,一、微生物基础介绍,（未清洗手）,（凉水洗手）,（洗洁精洗后手）,（洗洁精洗后，消毒剂消毒手）,微生物检验技术基础知识,第7页,二、,培养基,1,、培养基制备,培养基配制：,按处方配制，使用按处方生产符合要求脱水培养基,微生物检验技术基础知识,第8页,二、,培养基,配制时注意：,不得使用结块或颜色发生改变脱水培养基；,常见溶剂是纯化水、蒸馏水，防止使用自来水，因其中含有氯等抗菌物质；,脱水型培养基应完全溶解于水中，再分装灭菌；,加热助溶，注意不要过分加热；,如需要添加其它组分，加入后应充分混匀；,配制用容器最好用中性玻璃或聚乙烯容器；,配制培养基普通要在,1,小时内完成，假如室温高，配制时间过长，易使培养基受污染；,微生物检验技术基础知识,第9页,二、,培养基,2,、培养基灭菌,已配制好培养基最好尽快灭菌；,普通培养基采取湿热灭菌，即高压蒸汽菌，通常是,121,15,分钟；,湿热灭菌必须严格控制灭菌温度和时间，不可重复高温灭菌；,高压蒸汽灭菌锅在使用时，内置物品不能太多，不要堆积形成死角。,要定时对压力表等进行检定，检定周期普通为六个月；,定时对灭菌效果进行检验，可采取生物指示菌法、化学变色纸片（如湿热灭菌指示条）等进行验证。,微生物检验技术基础知识,第10页,二、,培养基,3,、培养基贮藏,贮藏注意：,灭菌后培养基应快速取出，防止长时间保留在灭菌锅内，造成过分灭菌；,培养基保留前应标上名称和制备日期（或到期日期）；,琼脂培养基不得在,0,或,0,以下存放；,琼脂平板最好现配现用，如置冰箱保留，不超出一周；,微生物检验技术基础知识,第11页,二、,培养基,4,、培养再融化方式,水浴加热,微波炉,注意：,固体培养基灭菌后再融化只允许一次,融化培养基应置于,45,50,水浴中，不得超出,8,小时,微生物检验技术基础知识,第12页,二、,培养基,5,、培养基性能评定,全部购回、配制好培养基均应进行质量控制试验（培养基适应性检验）,理化指标（,P55,）,微生物学指标（,P55,）,微生物检验技术基础知识,第13页,三、,菌种,1,、分类（概念）：,标,准,菌,株,由我国或国际菌种保藏机构保藏,标准贮备菌株,由标准菌株经一次传代得到培养物,商业派生菌株,由供给商提供全部特征与标准菌株等效菌株,工,作,菌,株,由标准贮备菌株以传代得到培养物,微生物检验技术基础知识,第14页,三、,菌种,注意：,标准贮备菌株、工作菌株都应进行纯度和特征确认,工作菌株传代次数不得超出,5,代（从菌种收藏机构取得标准菌株为第,0,代）,“,1,代”是指将活培养物接种到微生物生长新鲜培养基中培养。,试验室必须建立和保留其全部菌种进出、搜集、贮藏、保留、确认试验及销毁统计。,微生物检验技术基础知识,第15页,三、,菌种,标准菌株：,冻干粉（图,P63,）,甘油冻存管（图,P64,）,微生物检验技术基础知识,第16页,三、,菌种,菌种保藏机构：,CMCC,中国医学微生物菌种保藏管理中心,GIMCC,广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心,ATCC,美国经典菌种保藏中心,例：,CMCC,（,B,）,26003,菌种保藏机构,细菌,菌种编号（金黄葡萄球菌）,微生物检验技术基础知识,第17页,三、,菌种,2,、菌种判定,金黄色葡萄菌,CMCC(B)26003,甘露醇平板上划线分纯，经典菌落,为黄色圆形突起，表面湿润光滑；,革兰氏染色：阳性，球菌。,血浆凝固霉酶试验：阳性,微生物检验技术基础知识,第18页,三、,菌种,铜绿假单胞菌,CMCC(B)10104,溴化十六烷基三甲铵琼脂平板上划线分纯，经典菌落呈扁平，无定形、周围扩散，表面湿灰白色，周围有蓝绿色素扩散。,氧化酶试验：阳性,绿脓菌素：阳性,革兰氏染色：阴性，杆菌；,微生物检验技术基础知识,第19页,三、,菌种,白色念珠菌,CMCC(B)98001,沙氏葡萄糖琼脂平板上划线分纯，经典菌落乳白色，表面光滑有浓酵母气味。,革兰氏染色：阳性，菌体大，球菌。,芽管试验：阳性,微生物检验技术基础知识,第20页,三、,菌种,3,、菌种保藏,A,：,甘油冷冻管保藏法,保藏温度：,30,80,；保藏菌种使用期：,1,2,年,优点：保留期较长，重复传代造成菌种变异风险较小；,缺点：操作相对复杂，成本较高。,B,：,斜面低温保藏法,保藏温度,4,左右，保藏时间,1,3,个月，但铜绿假单胞菌不宜用本法保留。,优点：操作简便，成本低，比较轻易掌握；,缺点：保留期比较短，重复传代有引发变异可能。,。,保藏温度,保藏,使用期,优点,缺点,甘油冷冻管,保藏法,-30,80,12年,保留期较长，,重复传代造成菌种变异风险较小,操作相对复杂，,成本较高,斜面低温,保藏法,4,左右,13个月,操作简便，,成本低，,比较轻易掌握,保留期比较短，,重复传代有引 起变异可能；,铜绿假单胞菌不宜用本法保留。,微生物检验技术基础知识,第21页,三、,菌种,4,、菌种使用和销毁,过期菌种应及时销毁，销毁时应经,121,30,分钟生物灭活处理。,微生物检验技术基础知识,第22页,四、微生物程度检验法,1,、定义,微生物程度检验法系检验非要求灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度方法。,2,、检验项目,定量检验细菌数、霉菌及酵母菌数,定性检验控制菌（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念球菌）,检验环境：与无菌检验相同,微生物检验技术基础知识,第23页,四、微生物程度检验法,3,、检验量,指一次检验用量；,10g,或,10ml,，膜剂为,100cm2,，珍贵药品、微量包装药品检验量能够酌减。,4,、供试液制备,依据供试品理化特征与生物特征，采取适宜方法制备供试液；,供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不超出,45,。,微生物检验技术基础知识,第24页,四、微生物程度检验法,制备标准：,简便、快速！,供试液从制备至加入检验用培养基，不得超出,1,小时。,微生物检验技术基础知识,第25页,四、微生物程度检验法,供试品分类,液体供试品,固体、半固体或黏稠性供试品,需用特殊供试液制备方法供试品,非水溶性供试品,膜剂供试品,肠溶及结肠制剂供试品,气雾剂、喷雾剂供试品,贴膏剂供试品,具抑菌活性供试品：,培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法,微生物检验技术基础知识,第26页,四、微生物程度检验法,5,、方法验证,5.1,验证菌株,大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉,5.2,计数方法验证,当建立产品微生物程度检验法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证，以确认所采取方法适合于该产品细菌、霉菌及酵母菌数测定。,若产品组分或原检验条件发生改变可影响检验结果时，计数方法应重新验证。,微生物检验技术基础知识,第27页,四、微生物程度检验法,试验组,薄膜过滤法计数时：取要求量供试液，过滤，冲洗，在最终一次冲洗液中加入,50,100cfu,试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。,菌液组,测定所加试验菌数（,50,100cfu,）,供试品对照组,取要求量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数,稀释对照组,用对应稀释液替换供试品，加入,50,100cfu,试验菌，按试验组供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。,微生物检验技术基础知识,第28页,四、微生物程度检验法,验证方法：,验证试验最少应进行,3,次独立平行试验，并分别计算试验菌每次试验回收率不低于,70%,，若任一次试验中试验组菌回收低于,70%,，应采取适宜方法消除供试品抑菌活性，并重新进行进行方法验证。,微生物检验技术基础知识,第29页,四、微生物程度检验法,5.3,控制菌检验法验证,当建立药品微生物程度检验法时，应进行控制菌检验方法验证，以确认所采取方法适合于该药品控制菌检验。,采取薄膜过滤法时，取要求量供试液，过滤，冲洗，试验菌（,10,100cfu,）应加在最终一次冲洗液中，依法操作。,若上述试验检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检验法进行供试品该控制菌检验；,若试验组未检出试验菌，应采取对应方法消除供试品抑菌活性，并重新进行方法验证。,微生物检验技术基础知识,第30页,四、微生物程度检验法,5.4,细菌、霉菌及酵母菌检验,检验方法：,平皿法和薄膜过滤法,按已验证计数方法进行供试品细菌、霉菌及酵母菌菌数检验,微生物检验技术基础知识,第31页,四、微生物程度检验法,菌落汇报规则：,细菌、酵母菌宜选取平均菌落数小于,300cfu,；,霉菌宜选取平均菌落小于,100cfu,稀释级，作为菌数汇报（即两位有效数字）依据。,如各稀释级平板均无菌落生长，或仅最低稀释级平板有菌落，但平均菌落数小于,1,时，以,1,乘以最低稀释倍数值汇报菌数。,微生物检验技术基础知识,第32页,四、微生物程度检验法,菌落汇报规则示例,各稀释级（供试液,1ml/皿）平均菌落计数（cfu）,菌数汇报数,（cfu/ml.g）,原液,1：10,（-1）,1：10,2,（,-2）,1：10,3,（,-3）,1,64,8,2,640,2,420,64,8,6400,3,不可计,420,64,64000,4,0,0.5,0,100,5,0,0,100,6,0,0,0,10,7,0,0,0,1,例：菌数汇报规则表,1,微生物检验技术基础知识,第33页,四、微生物程度检验法,5.4.2,薄膜过滤法,滤膜孔径小于,0.45,m,，直径普通为,50mm,，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量不超出,100ml,，总冲洗量不得超出,1000ml,。,贴膜,菌面朝上于对应琼脂培养基平板上培养，每种培养基最少制备一张滤膜。,阴性对照试验,（不得有菌生长）,菌落汇报规则,每张滤膜上菌落数应不超出,100cfu,，若滤膜上无菌生长，以,1,乘以稀释倍数值汇报菌数。,微生物检验技术基础知识,第34页,四、微生物程度检验法,5.5,控制菌检验,供试品控制菌检验应按已验证方法进行，增菌培养基实际用量同控制菌检验方法验证。,阳性对照试验：,加菌量为,10,100cfu,，阳性对照试验应检出对应控制菌。,阴性对照试验：,取稀释液,10ml,代替供试液，阴性对照应无菌生长。,按照不一样给药路径，必检控制菌不一样。,微生物检验技术基础知识,第35页,四、微生物程度检验法,不一样给药路径制剂应检控制菌汇总,药品给药路径,应检控制菌,说明,局部给药制剂,金黄色葡萄球菌,全部制剂,铜绿假单胞菌,白色念珠菌,阴道给药,口服制剂,大肠埃希菌,全部品种,大肠菌群,含中药原药粉、,沙门菌,含动物组织（提取物）,给药,多路径给药制剂,同时检验各给药路径应检控