单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,黏性末端,黏性末端,1.,限制性核酸内切酶,二、,基因工程的“,基本,工具”,EcoRI,黏性末端黏性末端 1.限制性核酸内切酶二、基因工程的“基本工,1,1.,限制性核酸内切酶,一种限制性内切酶只能,识别,双链,DNA,分子 的某种,，并且使每一条链中,的两个核苷酸之间的,断开（,切割,DNA,分子）,a.来源：,b.作用：,c.,作用结果：,二、,基因工程的“,基本,工具”,形成,平未端,（,SmaI,）及,黏性未端,（,EcoRI,）,主要从原核细胞分离,P5,特定的核苷酸序列,特定部位,磷酸二酯键,1.限制性核酸内切酶 一种限制性内切酶只能识别双链D,2,2.DNA,连接酶,“,分子缝合针”,种类,来源,作用部位,连接末端,连接对象,Ecoli DNA,连接酶,T,4,DNA,连接酶,大肠杆菌,T,4,噬菌体,磷酸二酯键,黏性末端,黏性末端和平末端,DNA片段,2.DNA连接酶“分子缝合针”来源作用部位连接末端,3,种类,项目,限制酶,DNA,连,接酶,DNA,聚合酶,解旋酶,作用底物,作用部位,作用特点,作用结果,DNA,分子,DNA,分子,片段,脱氧核苷酸,DNA,分子,磷酸二,酯键,磷酸二,酯键,磷酸二,酯键,碱基对间,的氢键,切割目的基因及载体，能专一性识别双链,DNA,分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的,磷酸二酯键断开,将双链,DNA,片段“缝合”,起来，,恢复,被限制酶切开了的两个核苷酸之间的,磷酸二酯键,只能将,单个,脱氧核苷酸,添加到脱氧核苷酸链,上,将,DNA,两条链之,间的,氢键,打开,形成黏性末端或平末端,形成重组,DNA,分子,形成新的,DNA,分子,形成单链,DNA,分子,种类限制酶DNA连DNA解旋酶作用底物作用部位作用特点,4,下图为,DNA,分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制性核酸内切酶、,DNA,聚合酶、,DNA,连接酶、解旋酶作用的正确顺序是,(,),A,B,C,D,C,下图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限,5,据右图所示，有关工具酶功能的叙述不正确的是（）,A.,限制性内切酶可以切断,a,处，,DNA,连接酶可以连接,a,处,B.DNA,聚合酶可以连接,a,处,C.,解旋酶可以使,b,处解开,D.,连接,C,处的酶可以为,DNA,连接酶,D,据右图所示，有关工具酶功能的叙述不正确的是（）D,6,3.,分子运载车,运载体,（,1,）作用：,将目的基因送入受体细胞,（,2,）具备的条件：,a.,能在受体细胞中稳定存在并复制,b.,具有一个或多个酶切位点，便于目的基因插入,.,c.,有标记基因，便于筛选,.,d.,对受体细胞无害,.,质粒,、噬菌体、动植物病毒,（,3,）种类：,质粒,细菌拟核,DNA,之外结构简单、能,自主复制,的很小的,环状,DNA,分子,。,3.分子运载车运载体（1）作用：将目的基因送入受体细,7,特别提醒,一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人们根据不同的目的和需要，对某些天然的载体进行人工改造,限制酶,切割位点,所处的位置必须是在,所需的标记基因之外,，这样才能保证标记基因的完整性，有利于对目的记忆的检测。,跟踪训练1,特别提醒一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人,8,二、基因工程的基本操作程序（步骤）,获取目的基因,构建表达载体,导入受体细胞,目的基因检测与鉴定,第一步,第二步,第三步,第四步,二、基因工程的基本操作程序（步骤）获取目的基因构建表达载体导,9,（一）目的基因的,获取,2.,获取方法,（2）,.,从,基因文库,中获取目的基因,1,）基因组文库（鸟枪法）,提取某生物,全部,DNA,用适当,限制酶切割,许 多,DNA,片段,与载体连接,导入受体菌群,该生物基,因组文库,1.目的基因：,主要是指编码蛋白质的基因,2,）部分基因文库（CDNA）,（1）,.,从供体细胞,直接提取,（一）目的基因的获取2.获取方法（2）.从基因文库中获取目的,10,（3）利用,PCR,技术扩增目的基因,1）原理：,2）条件：,DNA,复制,目的基因（模板）、引物、原料（4种脱氧核苷酸）、耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）、能量等,3）过程：,高温变性（,9095,）,低温退火（,5560,）,中温延伸（,7075,）,多次重复,（3）利用PCR技术扩增目的基因1）原理：2）,11,4）,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循环 的次数）,指数,2,n,（4）,.,人工合成,1）利用相应mRNA,反转录,形成,mRNA,逆转录酶,杂交双链,核酸酶,单链,DNA,DNA,聚合酶,双链,DNA,2）,根据已知的氨基酸序列合成DNA,蛋白质的氨基酸序列,推测,mRNA,的核苷酸序列,推测,基因的核苷酸序列,化学合成,目的基因,放入DNA合成仪中,4）方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循环,12,1.,构建目的：,使目的基因在受体细胞中,稳定存在,，并且可,遗传给下一代,，同时，使目的基因能够,表达和发挥作用,。,2.,构建零件及其作用,（,1,）,目的基因,（,2,）,启动子,：是基因首端上RNA聚合酶的识别和结合的位点，驱动转录。,（二）基因表达载体的构建（核心）,（,3,）,终止子,：位于基因尾端，使转录终止,（,4,）,标记基因,：,便于筛选出含有目的基因的受体细胞（常使用抗性基因或荧光蛋白基因作为标记基因）,1.构建目的：使目的基因在受,13,DNA,连接酶,重组,DNA,分子（重组质粒）,3.,基因表达载体的构建一般过程,基因表达载体,连接启动子、终止子等,质粒,DNA,分子,限制酶处理,一个切口,两个黏性末端,两个切口,四个黏性末端,同一种,目的基因,注意,：,构建过程中工具酶的使用与任意连接的现象,DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）3.基因表达载体的构建,14,（三）将目的基因导入受体细胞,生物种类,受体细胞,导入方法,植物,动物,微生物,体细胞或受精卵,受精卵,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞处理法,（三）将目的基因导入受体细胞生物种类受体细胞导入方法植物动物,15,1.,导入植物细胞,（,农杆菌转化法,）,Ti,质粒的,T-DNA,上,目的基因,插入,转入,农杆菌,导入,植物细胞,植物细胞染色体,DNA,插入,表达,2.,导入动物细胞,(,显微注射技术,),含目的基因的表达载体,显微注射,动 物 的,受 精 卵,含目的基因的受精卵,分裂,分化,早期胚胎,雌性动物输卵管或子宫,发,育,转基因动物,移 植,1.导入植物细胞（农杆菌转化法）Ti质粒的T-DNA上目的基,16,3.,将目的基因导入微生物细胞,感受态细胞吸收,DNA,表达载体与感受态细胞混合,用Ca,2+,处理细胞,（CaCl,2,溶液）,感受态细胞,原核生物特点：繁,殖快、单细胞、遗传物质少,方法：,3.将目的基因导入微生物细胞感受态细胞吸收DNA表达载体与感,17,检查是否成功,导入与表达,1.,分子检测,导入检测：是否插入了目的基因,转录检测：是否转录出了,mRNA,翻译检测：是否翻译成蛋白质,方法,DNA分子杂交,(DNA-DNA),方法,分子杂交,(DNA-mRNA),方法,抗原,-,抗体杂交,2.,个体鉴定,:,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,（四）目的基因的检测与鉴定,（根据是否显现出,杂交代,判断）,检查是否成功导入与表达1.分子检测导入检测：是否插入了,18,特别提醒,师说,P,220,目的基因的,插入位点不是随意,的，基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子,之间的部位,基因工程操作过程中,只有第三步,（将目的基因导入受体细胞）,没有碱基互补配对现象,，第一步存在逆转录法获得DNA，第二步存在黏性末端连接现象，第四步检测存在分子水平杂交方法。,以,目的基因,的单链作为分子杂交技术的基因探针,跟踪训练2,特别提醒 师说P220目的基因的插入位点不是随意的，基因,19,三、基因工程的应用,（一）植物基因工程,1.,抗虫转基因植物（,如转基因抗虫棉,减轻农药对环境的污染,）,2.,抗病转基因生物,（,抗病毒、细菌或真菌转基因植物,）,3.,抗逆转基因作物,（,如转,鱼抗冻蛋白基因,番茄、转基因抗除草剂玉米,）,4.,改良植物的品质（,如富含赖氨酸的转基因玉米、转基因延熟番茄,）,三、基因工程的应用（一）植物基因工程1.抗虫转基因植物（如转,20,（二）动物基因工程,1.,提高动物生长速度,如,转生长激素基因鲤鱼,2,.,改善畜产品的品质,如,低乳糖转基因牛（转肠乳糖酶基因）,3.,生产药物,生物反应器,（如乳腺生物反应器、膀胱生物反应器）,注：,构建基因表达载体时需在目的基因前加入在某器官,特异表达的启动子,，使目的基因只在特定器官中表达并被分泌。,如,牛乳腺生物反应器时基因表达载体包括,：,牛乳腺分泌蛋白基因及其启动子,+,目的基因,+,标记基因,+,终止子,+,复制原点,（二）动物基因工程1.提高动物生长速度 如转生长激素基因鲤鱼,21,4.,做器官移植供体,利用某种,调节因子抑制或设法除去,供体器官,抗原决定基因的表达,，获得,没有免疫排斥反应,的转基因克隆猪器官,（三）基因工程药物,利用基因工程方法制造转基因的,工程菌,，可高效率地生产出各种高质量、低成本的药品。,工程菌,:,用基因工程方法，使外源基因得到高效率表达的菌类细胞株系。,我国已生产的药物：,白细胞介素,-2,、干扰素、乙肝疫苗等,4.做器官移植供体利用某种调节因子抑制或设法除去供体器官抗原,22,（四）基因诊断与基因治疗,1.基因诊断：,用放射性同位素等标记的“,DNA,探针”检测肝炎病毒等病毒感染及遗传缺陷，不但准确而且迅速。,2.基因治疗：,把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的。,类型,体外基因治疗,体内基因治疗,（四）基因诊断与基因治疗 1.基因诊断：用放射性同位素等标,23,特别提醒,师说,P,221,并非所有的个体都可作为乳腺生物反应器：操作成功的应该是,雌性个体,，个体本身的繁殖速度较高，泌乳量、蛋白含量等都是应该考虑的因素。,基因治疗后，,缺陷基因没有改变,，基因治疗是把正常基因导入受体细胞中，以表达正常产物从而治疗疾病，对原来细胞中存在缺陷的基因没有清除或改变（课本P24）,特别提醒 师说P221并非所有的个体都可作为乳腺生物反应,24,