单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1,第十三章,基因工程和基因组学,2,1971,美国史密斯,细菌,限制酶,;,1972,伯格,限制酶分别酶切猿猴病毒,DNA,与,噬菌体,DNA,用,DNA,连接酶连接,新的,DNA,分子,;,1973,科恩将重组外源,DNA,片段与质粒连接起来,重组质粒,转入大肠杆菌,;,1974,异源真核生物基因在大肠杆菌中的表达,;,1982,基因工程方法在细菌中表达生产的人体胰岛素进入市场,;,1985,烟草花叶病毒的外壳蛋白基因导入烟草获得成功,;,1986,基因工程生物实验性地释放到环境中,;,19901992,头一个转基因小麦,玉米,;,1994,基因工程西红柿在美国上市,;,1996,克隆羊多利诞生,.,现在,利用基因工程技术创建新的生命形态,生产药品,疫苗,牛奶和食品,诊断和治疗遗传疾病,.,3,第一节,基因克隆所需要的酶,4,一、限制性内切核酸酶,1,、限制性内切核酸酶的发现和限制性,修饰现象,限制作用,修饰作用,G AATTC,CTTAAG,GAATTC,EcoR,MEcoR,限制性内切核酸酶,EcoR,和甲基化转移酶,进行限制和修饰作用图解,/,EcoR,CTTAAG,CTTAA G,GAATTC,5,2,、,型限制性内切核酸酶,EcoB,：,识别序列,T-G-A-,（,N,）,8,-T-G-C-T,；甲基化的位点 第,3,或第,9,腺嘌呤,Ecozk,：识别序列,A-A-C-,（,N,）,6-G-T-G-C,；甲基化的位点 目前还不清楚,特点：,1kb,左右距离进行随机切割，,70,个左右的核苷酸，基因工程中运用极为有限,6,3,、,型限制性内切核酸酶,2300,多种，可识别,230,多种不同的,DNA,序列，基因工程中运用十分广泛。,特点：,（,1,）：能够识别特异性的,DNA,识别位点，这种识别位点通常是具有双链回文对称的结构；,（,2,）：切割后形成的双链,DNA,分子能够彼此互补并能够重新连接；,（,3,）：切割和修饰功能由两种不同的酶催化所完成；,（,4,）：切割不需要,ATP,和,SAM,作为活性催化因子。,7,3-CTTAA-5,3-G-5,5-G-3,5-AATTC-3,3-CTTAAG-5,5-GAATTC-3,EcoR,切割双链,DNA,产生,5,突出的黏性末端,例如：,EcoR;Hind;BamH;Pst;Xho,（黏性末端）,Sma;Xma,（平头末端）,Sfi,Mbo;Hph,3-GGG-5,3-CCC-5,5-CCC-3,5-GGG-3,3-GGGCCC-5,5-CCCGGG-3,Sma,切割双链,DNA,产生,5,突出的平头末端,8,4,、,型限制性内切核酸酶,与,型极为相似，,EcoP 1 EcoP 1 5,，运用极为有限,。,特点：,（,1,）：具有特异的识别位点，这种识别位点是非对称的；,（,2,）：切割位位点通常位于识别位点的,3,一侧,25,个碱基处进行单链切割,DNA,分子；,9,5,、其他限制性内切核酸酶,目前还发现了一些识别特殊碱基序列的限制性内切核酸酶，如在大肠杆菌中发现识别羟甲基胞嘧啶、,5-,甲基胞嘧啶和,4-,甲基胞嘧啶,DNA,分子的限制性内切酶,McrBC,。,10,6,、限制性内切核酸酶的命名和分类,几条基本原则：,（,1,）：利用属名的第一个字母和种名的前,2,个字母代表内切酶的来源。,Escherichia coli,Eco;Haemophilus influenzae,Hin;,（,2,）：内切酶的第,4,个字母表示酶来源的菌株和菌型。,EcoRI,中的,R,就表示该内切酶来自于大肠杆菌的,R,菌株,如果还不足以说明，有些情况下还加上数字,1,或,2,来表示例如,EcoR1,等。,（,3,）：在同一种菌株中分离获得的不同内切酶按照分离时间的先后以罗马数字加以标注。,来自流感嗜血菌的几种不同的限制性内切核酸酶就用,Hind,、,Hind,、,Hind,等表示。,11,7,、影响限制性内切核酸酶的一些因素和实际工作中采用的方案。,限制性内切核酸酶试剂盒，都提供了酶切优化配方。,（,1,）,DNA,的浓度和质量是影响酶切的最为关键的因素。,（,2,）酶切消化的缓冲液。,（,3,）酶切反应的温度。,（,4,）其他因素。反应的时间、消化过程中能否保持恒定的体积（在混合物上覆盖一层矿物油来防止缓冲液中的水分散失）,（,5,）部分消化和过消化。,12,8,、限制性内切核酸酶在生物技术中的运用。,限制性内切核酸酶在基因克隆中就象外科医生的手术刀。,（,1,）构建重组的,DNA,分子。,（,2,）探针的制备。,（,3,）,DNA,物理图谱的构建。,（,4,）,DNA,甲基化的分析,13,二、,DNA,聚合酶,DNA,聚合酶的重要特性是将脱氧核糖核酸连续地连接到双链,DNA,分子的,3-OH,末端，催化核苷酸的作用，形成长链的核酸分子。依据,DNA,聚合酶的作用和来源不同，可分为以下同种：,（,1,）大肠杆菌,DNA,聚合酶,、,Klenow,酶和,T,4,DNA,聚合酶,（,2,）,Taq DNA,聚合酶,（,3,）,RNA,反转录酶,（,4,）末端转移酶,（,5,）,DNA,连接酶,（,6,）碱性磷酸化酶,（,7,）其他种类的核酸化酶类,14,第二节,基因克隆所需要的载体,15,在基因工程实验中，载体作为一种运载工具通常用于装载外源的,DNA,片段或者基因，并将它转入受体细胞，使外源片段,DNA,分子能够在受体的细胞中进行繁殖，这种特殊的,DNA,分子称为基因克隆载体。,基因克隆载体必备的一些基本条件：,（,1,）,1,个或多个克隆位点。,（,2,）携带外源的,DNA,片段（基因）进入到宿主细胞中能够进行自我复制，或者外源的,DNA,片段能够整合染色体随着染色体的,DNA,复制而同步进行自我的复制。,（,3,）载体必须具有可供选择的标记，如抗生素标记。,（,4,）载体必须是安全的，不含有对受体细胞有害的基因，对于细胞的生长不会产生显著的影响。,16,一、基因工程载体种类,通常包括质粒载体、噬菌体载体（包括噬菌体和质粒为基础构建的,Cosmid,载体），人工染色体载体（,YAC,、,BAC,、,PAC,、,TAC,）等。,17,二、质粒载体：,质粒是存在于宿主细胞染色体外的一种裸露的双链,DNA,分子（或者,RNA,分子），在宿主细胞体内通常以共价闭合环状的超螺旋形式存在。,基因工程中通常使用,5kb,以下的质粒。商业化的质粒载体一般有如下的生物学特性：,（,1,）质粒,DNA,的复制,质粒是在宿主细胞中能够自我复制的遗传单元，它是存在于宿主染色体以外的非必要组成部分，它能够随着细胞的自我复制而分配到后代中去。,（,2,）质粒,DNA,的不亲和性,质粒往往不能在同一宿主细胞中共存。,（,3,）质粒的,DNA,接合性性,质粒往往具有促使宿主细胞与受体细胞相结合，从而使遗传物质从宿主细胞向受体细胞中转移。,18,2,、质粒载体的构建,用于基因克隆的质粒载体应具有操作方便、易于检测、插入后能够稳定不丢失的优点。,质粒构建的几个原则：,（,1,）质粒载体具有能自我复制的元件，这也是所有克隆载体必需的。,（,2,）质粒载体上具有允许外源基因插入的多克隆位点，实际上在实际运用的载体上具有的多克隆位点数为一个。,（,3,）质粒载体上同时必须有可供筛选的抗生素标记：已经在质粒载体上使用的抗生素标记基因包括,Amp,r,Ter,r,Kan,r,等。,（,4,）构建的质粒载体应该足够小：由于质粒载体在进行遗传转化时，转化的效率与载体的大小有关。,19,四、人工染色体载体,1,、人工染色体载体的种类,构建人工染色体必须满足几个基本的条件：必须具有行使正常染色体功能所必需的各种元件，主要是着丝粒、复制起点和端粒。,着丝粒是在细胞进行有丝分裂中期与纺锤丝微管相结合的部分，牵动染色体有规律地分配到子细胞中的部分。,端粒是保持染色体进行稳定性、染色体正常、精确地复制和维持染色体长度所必需的元件。,复制起点是所有生物进行,DNA,复制所必需的。,20,2,、酵母人工染色体（,yeast artificial chromosome,YAC,）,3,、细菌人工染色体（,bacterial artificial chromosome,BAC,）,4,、其他类型的人工染色体,P1,人工染色体（,P1 artificial chromosome,PAC,）,植物可转基因人工染色体（,transformation-competent artificial chromosome,TAC,）,21,不同类型载体的克隆外源片段能力比较,载体类型,克隆的外源片段长度,/kb,宿主细胞,质粒载体,5,大肠杆菌,噬菌体载体,15,噬菌体,Cosmid,载体,1545,大肠杆菌,Phagemid,载体,1545,大肠杆菌,YAC,2Mb,酵母,BAC,300kb,细菌,TAC,100kb,细菌,/,农杆菌,22,第三节,植物基因组文库的构建,23,基因库,(library):,是一组,DNA,和,cDNA,序列克隆的集合体植物基因组文库构建必须符合以下几个基本条件,（,1,）文库能够覆盖整个基因组,（,2,）插入的片段比较大：如插入的片段太小，基因组文库要求的克隆数目太多，不利于染色体的步移和组装。,（,3,）文库比较稳定，且容易保存和操作：外源的片段插入到载体以后片段本身不会丢失，并且片段之间不会发生重组现象。,24,植物基因组文库构建通常包括以下几个基本步骤,（,1,）大片段,DNA,克隆载体的准备,（,2,）大分子质量的植物基因组,DNA,制备。,（,3,）大片段,DNA,分子的部分酶切。,（,4,）载体与外源片段的连接。,（,5,）载体的遗传转化。,（,6,）克隆的挑取和验证及植物基因组文库的保存。,25,第四节,基因克隆的方法,26,模式植物：,水稻、拟南芥、烟草,基因测序基因功能需要大量基因基因克隆,基因克隆方法（几十种）：归纳为,5,大类,以已知序列为基础的基因克隆方法、以分子标记连锁图谱为基础的基因克隆方法、以人工突变体为基础的基因克隆方法、以表达差异为基础的,27,一、以已知序列为基础的基因克隆方法,1,、以氨基酸序列为基础的基因克隆方法,（最为经典）,通过对表达的或者差异的蛋白质分子的序列进行测定分析以后，获得该蛋白质的一段氨基酸的序列。根据编码不同氨基酸的密码子设计出一条简并引物，利用这条,RT-PCR,或者进行,RACE-PCR,扩增的方法克隆基因的全长。,2,、,RACE-PCR,与同源序列法扩增全长基因,RACE,（,rapid amplification of cDNA end,）即快速扩增,cDNA,末端可分为以下几个步骤：,A,：,mRNA,反转录为一链的,cDNA,B,：利用,5 cDNA,的帽子结构设计出的引物分别与基因的特殊引物进行,PCR,嵌套扩增得一条或者几条特异的,PCR,带型,C,：分别将这些带型克隆到质粒载体上进行,PCR,测序，通过分析和比较以后可以获得待克隆基因的,3,端的片段。,28,二、以分子标记连锁图谱为基础的基因克隆方法,A,：首先通过遗传分析将目的基因定位在染色体的一定区间内，或者说在目的基因的两侧获得若干个连锁的分子标记。,B,：基因组文库的构建,C,：进行染色体步移或者染色体登陆（基本思路是首先利用分子标记分离到与分子标记同源的插入克隆，然后通过重叠群的分析获得候选基因克隆的一种方法）。,D,：对候选基因片段的功能互补分析、序列测定和基因结构鉴定。,标记,1,标记,2,Ti-DNA,功能验证,图位基因克隆法的基本步骤和原理,功能验证,遗传转化,染色体步移（登陆）,基因定位,29,三、以人工突变体为基础的基因克隆方法,1,、转座子标签法,含有转座子和报告基因的载体构建,遗传转化,突变体筛选,反向,PCR,或者,TAIL-PCR,获得侧翼序列,利用侧翼序列为探