单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,DNA,mRNA,蛋白质,转录,反转录,翻译,核酸分子杂交,基因结构异常,基 因 表 达 异 常,PCR,DNA测序,核酸分子杂交,实时荧光定量PCR,反转录PCR,蛋白质芯片,ELISA,蛋白组织化学染色,Western-blot,基因芯片,基因诊断的技术和方法,DNAmRNA蛋白质转录反转录 翻译 核酸分子杂交 基因结构,1,感染性疾病的分子诊断课件,2,第四代：分子诊断（1978年始）,病因学诊断,分子诊断,第四代：分子诊断（1978年始）分子诊断,3,感染性疾病的分子诊断课件,4,基因病类型,1、感染性疾病：,病原生物的侵入如流感、肝炎、艾滋病,2、遗传性疾病：,如苯丙酮尿症、血友病等,3、复杂性疾病,，如肿瘤、原发性高血压,基因病类型1、感染性疾病：,5,感染性疾病的分子诊断课件,6,感染性疾病的分子诊断,严永敏,基础医学与医学技术学院,感染性疾病的分子诊断严永敏,7,第一节,诊断策略及诊断方法,标本处理,病毒的基因检测,病原菌的基因检测,第一节诊断策略及诊断方法,8,一般性检出策略和方法,针对特异性的核酸序列进行核酸分子探针,杂交,，或者利用常规,PCR,技术直接检出微生物的DNA/RNA，判断有无感染和是何种病原体感染。,完整检出策略和方法,按照诊断分型亚型耐药性检测的思路，利用多种基因诊断手段对感染性病原体进行分析。,一、分子诊断策略,一般性检出策略和方法 针对特异性的核酸序列进行,9,二、分子诊断方法,1.信号放大技术,（bDNA杂交捕获系统）,支链DNA（bDNA）技术,二、分子诊断方法1.信号放大技术（bDNA杂交捕获系统）支,10,杂交捕获系统,特点：,稳定性、重复性、特异性好,杂交捕获系统特点：,11,二、分子诊断方法,2.靶分子扩增技术,（PCR/TAS/LCR）,转录依赖的扩增系统（TAS）,二、分子诊断方法2.靶分子扩增技术（PCR/TAS/LCR）,12,连接酶链反应（LCR）,特点：,简单、快速、灵敏度高,连接酶链反应（LCR）特点：,13,1.标本选择,选择原则：,符合疾病的发病机制，反映病程,标本类型：,血浆、血清、全血或白细胞,核酸类型：,DNARNAmiRNA,三、标本处理,2.标本量、抗凝剂,3.标本保存、传送,4.标本预处理,1.标本选择选择原则：符合疾病的发病机制，反映病程三、标本处,14,1.阴性结果,注意：,灵敏度,核酸提取及扩增效率.,四、结果解释,2.阳性结果,3.定性检测结果,4.疾病状况的判断,注意：,特异性,可能的污染.,注意：,病情缓解患者.,1.阴性结果注意：灵敏度,核酸提取及扩增效率.四、结果解释2,15,1.弥补血清学诊断缺陷,注意：,窗口期,灵敏度,部分特殊病例.,五、应用及评价,2.不能培养或生长缓慢微生物,3.监测疾病状态,4.耐药性及分型检测,1.弥补血清学诊断缺陷注意：窗口期,灵敏度,部分特殊病例.五,16,第二节 病毒基因检测,乙型肝炎病毒（HBV）、人乳头瘤病毒（HPV）：,其DNA可以使用点杂交、PCR方法直接检出,。,丙型肝炎病毒（HCV）、人免疫缺陷病毒（HIV）：,其RNA可以使用RT-PCR方法直接检出,。,第二节 病毒基因检测乙型肝炎病毒（HBV）、人乳头瘤病毒（,17,HBV基因组结构,pre-s1,pre-s2,S,P,C,pre-c,X,乙 肝,pre-S1 pre-S1蛋白,pre-S2 pre-S2蛋白,S HBsAg,pre-C HBeAg,C HBcAg,P DNAP,X HBxAg,乙型肝炎病毒基因结构模式,分子诊断：,信号放大技术；PCR法；耐药性检测,HBV基因组结构pre-s1pre-s2SPCpre-cX乙,18,1.弥补血清学检测结果,诊断HBV,临床意义,2.缩小窗口期,快速诊断,3.定量检测,指导病情,4.检测耐药,指导用药,1.弥补血清学检测结果,诊断HBV临床意义2.缩小窗口期,快,19,丙型肝炎(HCV)基因诊断实例,丙型肝炎为RNA病毒，9500mer，编码3011-3033个氨基酸，具有高变异性。基因组组成：,E1,NS2,NS3,NS4,3-NCR,C,NS1/E2,NS5B,5-NCR,高变异区（编码衣壳和包膜蛋白）,（NCR:非编码区）,5-NCR为保守的区域，将引物设计在该区域，进行RT-PCR,可特异性的扩增HCV。,丙型肝炎(HCV)基因诊断实例丙型肝炎为RNA病毒，9500,20,分子检测方法：,1.HCV的RNA定性及定量检测,RT-PCR,巢式PCR,定量PCR,转录依赖的,扩增系统（如TAS）,分支DNA(bDNA),2.HCV基因分型鉴定,测序、real-time PCR等,分子检测方法：,21,感染性疾病的分子诊断课件,22,感染性疾病的分子诊断课件,23,1.监测临床疗效,临床意义,2.缩小窗口期,快速诊断,3.定量检测,4.免疫缺陷补充检测,1.监测临床疗效临床意义2.缩小窗口期,快速诊断3.定量检测,24,H1N1甲型流感,H1N1甲型流感,25,实验室检查,外周血象：白细胞总数一般不高或降低。重症患者多有白细胞总数及淋巴细胞减少，并有血小板降低；,血清学诊断：可使用间接ELISA、抗原捕捉ELISA、荧光免疫法等；,分子诊断？,实验室检查外周血象：白细胞总数一般不高或降低。重症患者,26,分子诊断策略,分子诊断策略,27,第三节 病原菌的基因检测,耐药菌株的监测:,结核分支杆菌耐药基因,rpoB,金黄色葡萄球菌耐药基因,MRSA,第三节 病原菌的基因检测耐药菌株的监测:,28,确认的归于此次暴发的最早病例：2008年9月1日,至2009年2月22日，发现651例，来自43个州，死亡8例,病例-对照调查：与花生酱相关，尤其某些花生酱饼干,流行病学和实验室调查发现源头为一个工厂生产的花生酱和花生,糊，这些产品同时也是多家食品生产厂家的中间材料。,花生酱污染导致的鼠伤寒沙门菌沙门菌暴发，美国，2008-2009,确认的归于此次暴发的最早病例：2008年9月1日花生酱污染导,29,确认的归于此次暴发的最早病例：2008年9月1日,至2009年2月22日，发现651例，来自43个州，死亡8例,病例-对照调查：与花生酱相关，尤其某些花生酱饼干,流行病学和实验室调查发现源头为一个工厂生产的花生酱和花生,糊，这些产品同时也是多家食品生产厂家的中间材料。,花生酱污染导致的鼠伤寒沙门菌沙门菌暴发，美国，2008-2009,确认的归于此次暴发的最早病例：2008年9月1日花生酱污染导,30,冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品,鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品,前增菌法,25gBPW225mL,36,1 一般4h，干蛋品18h24h,10mL,MM,（或,TTB,）100mL,10mL,SC,100mL,直接增菌法,25g灭菌生理盐水25mL,检样匀液25mL,MM,（或,TTB,）100mL,检样匀液25mL,SC,100mL,BS,DHL（或HE、WS、SS）,TSI,（排除A/A H,2,S结果）,，靛基质，尿素，KCN，赖氨酸,沙门氏菌血清学试验,甘露醇 山梨醇,H,2,S 靛 尿,KCN 赖,H,2,S 靛 尿,KCN 赖/,非如左述的各种反应结果,沙门氏菌血清学试验,ONPG,沙门氏菌,非沙门氏菌,42 18h24h,36,1 18h24h,42 18h24h,36,1 18h24h,36,1 40h48h,36,1 18h24h,微生物学检验 沙门氏菌检验,中华人民共和国国家标准,GB/T 4789.4-2003,冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工,31,样品,增菌,直接处理,选择性培养 基增菌,DNA提取,PCR,PCR快速检测,致食物中毒的细菌,样品增菌直接处理选择性培养 基增菌DNA提取PCRPC,32,M,M,33,