,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,*,阵发性睡眠性血红蛋白尿,的流式细胞术检测,1,阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测 1,PNH,(,paroxysmal nocturnal hemoglobinuria),是一种罕见的获得性克隆造血干细胞疾病。但近年来有增多趋势。我国北方多于南方。半数以上发生在,20-40,岁青壮年。男性多于女性，与遗传及种族无关。本病起病隐袭缓慢，呈慢性过程，以贫血、出血为首发症状者较多，以血红蛋白尿起病者较少。,2,PNH(paroxysmal nocturnal hemo,3,3,血红蛋白尿,睡眠有关，早晨较重，下午较轻,尿液外观为酱油或红葡萄酒样,;,伴乏力、胸骨后及腰腹疼痛、发热等,4,血红蛋白尿 睡眠有关，早晨较重，下午较轻 4,原因,因为补体作用最适宜的,pH,是,6.8,7.O,，而睡眠时呼吸中枢敏感性降低，酸性代谢产物积聚,5,原因因为补体作用最适宜的pH是6.87.O，而睡眠时呼吸中,6,6,研究历史,Strubing,第一次报道,PNH,Ham,和,Dingle,证明了,PNH,患者的红细胞在血清酸化条件下，易发生溶血，这就是现在普遍使用的,Ham,实验,1983,年证实,PNH,患者,GPI,合成异常,1993,年,pig-a,基因突变,7,研究历史 Strubing第一次报道PNH7,流式细胞术,原理：,X,染色体上,PIG-A,（造血干细胞经获得性体细胞基因）突变,导致糖化肌醇磷脂,(GPI),锚合成障碍,导致由,GPI,锚接在细胞膜上的一组膜蛋白丢失，包括,CD16,、,CD55,、,CD59,等,8,流式细胞术 原理：8,9,9,GPI,锚连接蛋白,补体调接蛋白,衰变加速因子(,DAF,或,CD55)、,膜攻击复合物抑制因子(,MACIF,或,MIRL,或,CD59)、,补体,C8,结合蛋白(,HRF,或,C8bp)、,膜辅助蛋白(,MCP)。,粘附分子,淋巴细胞功能相关抗原-3(,LFA-3,或,CD58)、,Blast-1/CD48、CD67、CD66。,10,GPI锚连接蛋白 补体调接蛋白10,GPI,锚连接蛋白,酶类,红细胞乙酰胆碱脂酶(,AchE)、,中性粒细胞碱性磷酶酸酶(,NAP)、5,外核酸酶(,CD 73)。,受体类,中性粒细胞,III,型,Fc,受体(,FcRIIIb,或,CD16)、,单核细胞分化抗原(,CD14)、,尿激酶型纤溶酶原激活物受体(,u-PAR)。,血型抗原,CD55,携带的,Comer,抗原、,AchE,携带的,Yt,抗原。,11,GPI锚连接蛋白 酶类11,1,型细胞,CD59,完全阳性,12,1型细胞 CD59完全阳性12,补体激活途径,C1 C1,C2,C4 C4b2b,(C3,转化酶）,C3 C3b,P,（备解素）,PC3bBb C3bB,(C5,转化酶）,C4b2b3b,或,PC3bBb C8 C9,C6C7,C5 C5b C5b678 C5b-9(MAC),CD59,替代途径,经典途径,CD55,Ag-Ab,13,补体激活途径 C1 C1C,分析,1.,红系及粒系,FSC/SSC,设门,报告标本中,CD55,、,CD59,阴性比例,14,分析1.红系及粒系FSC/SSC设门14,做,2030,份正常人血样划定阳性区（,区）范围,同型阴性对照界定,区范围，,中间的区域即为,区。,15,做2030份正常人血样划定阳性区（区）范围15,16,16,根据,CD59,可以将,PNH,细胞分为,3,型,1,型细胞,CD59,完全阳性,正常细胞,2,型细胞,CD59,部分阳性,补体中度敏感细胞,3,型细胞,CD59,完全阴性,补体敏感细胞,17,根据CD59可以将PNH细胞分为3型17,18,18,19,19,20,20,CD55,和,CD59,同时部分或完全缺失是,PNH,的典型表现，单,GPI,缺失不能确诊。,CD59,重要性大于,CD55,单,CD55,缺乏时并不因此改变红细胞对补体的敏感性而造成溶血,CD59,的缺失会增加补体的敏感性,临床上以,CD59,缺失作为诊断标准是一个趋势。,解决了一切以补体溶血为基础的实验诊断方法在诊断,PNH,的不确定性,意义,21,CD55和CD59同时部分或完全缺失是PNH的典型表现，单G,其它细胞的,PNH,检测,PNH,患者的红细胞、粒细胞、单核细胞及淋巴细胞上,GPI,锚连膜蛋白部分或全部丧失。,粒细胞,单核细胞,淋巴细胞,红细胞,骨髓,PNH,克隆出现比外周血早，网织红细胞略早于红细胞,22,其它细胞的PNH检测PNH患者的红细胞、粒细胞、单核细胞及淋,其它细胞的,PNH,检测,应用,FSC/SSC,设门分析时会有许多脱颗粒的中性粒细胞，这时只使用物理特征无法准确设定粒细胞门了，这时必须使用系列标志,/SSC,设门,:CD15,，,CD33,。,CD64,设门，分析单核,CD14,CD55,CD59,，,PNH,病人检测,GPI,缺乏的血小板不容易分辨,不能只根据淋巴细胞上,GPI,相关蛋白的表达来诊断。,23,其它细胞的PNH检测应用FSC/SSC设门分析时会有许多脱颗,与其他实验比较,1.,酸溶血试验,(Ham,试验,),患者红细胞与含,5%,盐酸的正常同型血清混合，,pH6.4,，,37,孵育,2,小时，溶血明显。本试验特异性高，敏感性差。,2.,蛇毒因子溶血试验蛇毒因子能通过补体交替途径，使补体敏感的红细胞发生溶血。本试验特异性强，敏感性优于酸溶血试验。,3.,热溶血试验和蔗糖溶血试验,因特异性差，常作为筛选方法。,24,与其他实验比较 1.酸溶血试验(Ham试验)患者红细胞与含,具有,PNH,克隆的血液病,检测粒细胞,GPI,锚连蛋白表达,病种,检测例数,缺失例数,(%),AA 115 25 (22%),MDS 39 9 (23%),并发现,MDS,有,PNH,表达者,ATG,（,人胸腺细胞免疫球蛋白）,治疗有效,(An Intern Med 1999,，,131:401),25,具有PNH克隆的血液病 检测粒细胞GPI 锚连蛋白表达25,PNH,和,AA,关系,相当密切，可以相互转化且并存,AAPNH,较多(15%)，,PNHAA,少,20%30%,PNH,可伴骨髓再障,AA(ATG,治疗后),PNH 1031%,AA-PNH,综合征 16.5%(我国),50%,AA,外周血或骨髓可检出,PNH,克隆,AAPNH,生存率要高于,PNHAA,MDS-RA,如捡出,PNH,克隆者预后好，且,ATG(,人胸腺细胞免疫球蛋白,),治疗有效。,PNH,对,AA,和,MDS,的“自然治疗”，而“,AA,救了,PNH”。,26,PNH和AA关系 相当密切，可以相互转化且并存26,PNH,克隆见于淋巴增殖性疾病,检测病种 例数,NHL 87,HD 55,红细胞,CD55/CD59,CLL 49,缺失检出率 9.2%,ALL 22,HCL 4,(Hematol J 2001，2:33),27,PNH 克隆见于淋巴增殖性疾病 检测病种,PNH,克隆见于浆细胞病,检测红细胞,CD55/CD59,缺失,病种 检测例数 缺失例数(%),MM 62 6,WM 7 2,MGUS 6 1,HCD 2 1,合计 77 10 (12.9%),(,Int J Hematol 2002,75:40),28,PNH克隆见于浆细胞病 检测红细胞 CD55/CD59 缺,FLAER,嗜水气单胞菌溶素变异体,(FLAER),。,1998,年,Diep,等报道嗜水气单胞菌,(HEC),毒素能特异地与细胞膜上,GPI,锚连蛋白结合，随后立即聚合成多具体，插入细胞膜脂质双层，在膜上形成孔洞致溶破。,PNH,细胞缺乏,GPI,蛋白而抵抗毒素保持细胞完好。,29,FLAER嗜水气单胞菌溶素变异体(FLAER)。29,FLAER,FLAER,在所有具有,GPI,锚连蛋白的白细胞上都有特异性表达，所以正常人及非,PNH,贫血,FLAER,成,100%,阳性。,是目前诊断,PNH,最敏感、特异的方法。,FLAER,对,PNH,克隆检出的敏感性为,0.1%,，其它靶向标记检出率的敏感性为,1%,；,30,FLAERFLAER在所有具有GPI锚连蛋白的白细胞上都有特,结果分析,1.,设门,CD45/SSC,2.,标记,CD15,，,CD14,，,CD45,，,FLAER,检测,PNH,粒、单核及淋巴细胞，报告标本中各系细胞,FLAER,阴性比例,31,结果分析1.设门 CD45/SSC31,32,32,33,33,FLAER,目前,FLAER,一般用于有核细胞的检测，不能评价红细胞的,PNH,克隆。,由于红细胞表面没有气单胞菌溶素前体产生所需要的蛋白水解酶类，尽管表达在红细胞表面的血型糖蛋白不是锚连蛋白，但是由于血型糖蛋白与气单胞菌溶素前体结合力较弱，因此限制了,FLAER,在红细胞中的应用。,34,FLAER目前FLAER一般用于有核细胞的检测，不能评价红细,与,CD55,、,CD59,比较，,Flaer,对,PNH,患者对中性粒细胞的测定最为清晰、准确,临床上高度怀疑，而,CD55,、,CD59,不能确诊的病例，可以结合,F1aer,检查，获得明确诊断,35,与CD55、CD59比较，Flaer对PNH患者对中性粒细胞,谢谢！,36,谢谢！36,