单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,0.0,*,分子生物学基本研究法（上）,DNA,、,RNA,及蛋白质操作技术,第五章,0.0,1,分子生物学基本研究法（上）DNA、RNA及蛋白质操作技术第,扉页：,当你进入实验室时，要像脱去外衣那样放下你的想象力，因为实验操作中不能有一丁点儿的想象，否则，你对事物的观察就会受影响；当你翻开书本的时候，你又必须尽可能展开想象的“翅膀”，否则，你就不可能走在别人的前面。,0.0,2,扉页：0.02,RNA,基本操作技术,真核生物基因组,DNA,庞大，有大量重复序列，很难直接分离得到靶基因片段。而,cDNA,来自反转录的,mRNA,，无冗余序列，通过筛选,cDNA,文库，可较快地分离到相关基因。,0.0,3,RNA基本操作技术0.03,5.3 RNA,基本操作技术,5.3.1,总,RNA,的提取,5.3.2 mRNA,的纯化,5.3.3 cDNA,的合成,5.3.4 cDNA,文库的构建,5.3.5,基因文库的筛选,0.0,4,5.3 RNA基本操作技术5.3.1 总RNA的提取0.04,5.3.1,总,RNA,的提取,细胞中的总,RNA,包括：,mRNA 1%5%,rRNA 80%85%,tRNA,sRNA,15%20%,0.0,5,5.3.1 总RNA的提取细胞中的总RNA包括：mRNA,Trizol,总,RNA,提取试剂,TIANGEN,rRNA,电泳后的三条特征性条带,28S,、,18S,、,5S(,特别是,28S,和,18S,特征性条带,),是鉴定总,RNA,纯度和完整性的重要参数。,0.0,6,Trizol总RNA提取试剂 TIANGEN,RNA,的抽提方法,1.,实验室常用方法：,异硫氰酸胍苯酚抽提法,Trizol,试剂：苯酚和异硫氰酸胍组成，可迅速破坏细胞结构，释放细胞质及细胞核中的,RNA,，并使核糖体蛋白与,RNA,分子分离，还能保证,RNA,的完整。,Trizol,提取步骤：首先在液氮中研磨材料，匀浆，加入,trizol,试剂，再加入氯仿抽提，分离水相，异丙醇沉淀。,0.0,7,RNA的抽提方法1.实验室常用方法：异硫氰酸胍苯酚抽提法0,RNA Extraction by TRIzol,0.0,8,RNA Extraction by TRIzol0.08,使用BioSpcetrometer分光光度计进行快速检测核酸,0.0,9,使用BioSpcetrometer分光光度计进行快速检测核酸,m,RNA Extraction from Cell Culture,0.0,10,mRNA Extraction from Cell Cult,m,RNA Extraction from,Tissue,0.0,11,mRNA Extraction from Tissue0.0,2.,硅胶膜纯化柱法,将含有目的,RNA,的细胞破碎液通过该柱，,RNA,吸附在硅胶膜上，然后在低盐浓度下可从硅胶上直接洗脱,RNA,。,0.0,12,2.硅胶膜纯化柱法0.012,RNA,的浓度和纯度的判断：,可通过测定其,OD,260,和,OD,280,OD,260,1,时，相当于浓度为,40,g/mL,，当,OD,260,/OD,280,1.8,2.0,时，说明,RNA,纯度较好。,0.0,13,RNA的浓度和纯度的判断：0.013,5.32.mRNA,的纯化,寡聚（,dT,）纤维素柱色谱法：,利用,mRNA3,端含有,PolyA,+,的特点，当,RNA,流经寡聚,dT,纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，,mRNA,被特异性地结合在柱上，再用低盐溶液或蒸馏水洗脱,mRNA,。经过两次此柱可得到较高纯度的,mRNA.,0.0,14,5.32.mRNA的纯化寡聚（dT）纤维素柱色谱法：0.,0.0,15,0.015,Promega PolyAT tract mRNA,分离系统分离多聚,(A)mRNA,。将用生物素标记的寡聚,(dT),引物与细胞总,RNA,共温育，加入与微磁球相连的抗生物素蛋白，用磁场吸附通过寡聚,(dT),引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的,mRNA,。,0.0,16,Promega PolyAT tract mRNA 分离系统,图,5-14,PolyATtract,mRNA,的分离纯化过程简图。,0.0,17,图5-140.017,每个,Oligotex Kit,包括用于结合,poly A+mRNA,的,Oligotex,树脂，和用于洗涤、洗脱结合的,mRNA,的离心柱。,Oligotex mRNA Kits,可从总,RNA,中纯化,mRNA,，回收,poly A+,体外转录子。,Oligotex Direct mRNA Kits,可从细胞和组织中纯化,mRNA,。,mRNA Extraction from Total RNA,0.0,18,每个Oligotex Kit 包括用于结合poly A+m,5.3.3 cDNA,的合成,cDNA,（,complementary DNA,）：在体外以,mRNA,为模板，利用反转录酶和,DNA,聚合酶合成的一段双链,DNA,。,0.0,19,5.3.3 cDNA的合成cDNA（complementar,图,5-15 cDNA,合成过程示意图。,第一链,cDNA,的合成：以,mRNA,为模板，反转录成,cDNA,，由反转录酶催化，需引物（常用,oligo dT,）。,第二链,cDNA,的合成：以第一链为模板，由,DNA,聚合酶催化。,0.0,20,图5-15 cDNA合成过程示意图。0.020,图,5-16 cDNA,合,成中的分子修饰。,0.0,21,图5-16 cDNA合0.021,cD,NA,的,合成,0.0,22,cDNA 的合成0.022,5.3.4 cDNA,文库的构建,cDNA,文库：,是指将某种生物体基因组转录的全部,mRNA,经反转录产生的,cDNA,片段分别与克隆载体重组，储存于某种受体菌中，该群体就称该生物基因组的,cDNA,文库。,0.0,23,5.3.4 cDNA文库的构建cDNA文库：是指将某种生物体,构建,cDNA,文库的基本程序：,mRNA,的提取和纯化。,合成,cDNA,第一链。,将,mRNA-cDNA,杂交分子转变为双链,cDNA,分子。,将双链,cDNA,重组到噬菌体载体或质粒载体上。,将重组子体外包装成具有感染力的噬菌体颗粒导入到大肠杆菌寄主细胞中增殖。,0.0,24,构建cDNA文库的基本程序：0.024,构建基因组文库的基本程序：,0.0,25,构建基因组文库的基本程序：0.025,构建基因组文库的基本程序：,0.0,26,构建基因组文库的基本程序：0.026,构建基因组文库的基本程序：,0.0,27,构建基因组文库的基本程序：0.027,基因文库的建立,0.0,28,基因文库的建立0.028,基因组,DNA,文库,cDNA,文库,基因组,DNA,文库与,cDNA,文库的比较,0.0,29,基因组DNA文库cDNA文库基因组DNA文库与cDNA文库的,基因组文库与,cDNA,文库的差别,基因组文库中包含了所有基因，而,cDNA,文库只包含表达的基因，缺乏内含子和调控序列，在研究基因结构时用处不大,cDNA,文库代表了,mRNA,的来源，转录本在丰度上有差别，而基因组文库在理论上均等地代表了所有基因序列,不同细胞类型制备的,cDNA,文库包含一些共同序列和独特序列，可用于分离差别表达的基因，基因组文库中不能,基因组文库由于含有不表达序列，比,cDNA,文库大,mRNA,在不同组织之间存在丰度差异，因此,cDNA,文库在构建时对于,mRNA,含量较少的就比较困难，而基因组文库不存在这样的问题,0.0,30,基因组文库与cDNA文库的差别基因组文库中包含了所有基因，而,5.3.5,基因文库的筛选,基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组,DNA,分子的特定克隆过程。,0.0,31,5.3.5 基因文库的筛选基因文库的筛选是指通过某种特殊方法,5.3.5.1,核酸杂交法,0.0,32,5.3.5.1 核酸杂交法0.032,5.3.5.2 PCR,筛选法,前提：已知足够的序列信息并获得基因特异性引物。,步骤,：（,1,）,将文库保存在多孔培养板上,（,2,）用设计好的目的基因探针对每个孔进行,PCR,筛选，鉴定出阳性孔,（,3,）把阳性孔中的克隆稀释到次级多孔板中进行,PCR,筛选。,（,4,）重复以上程序，直至鉴定出与目的基因对应的单个克隆为止。,0.0,33,5.3.5.2 PCR筛选法前提：已知足够的序列信息并获得基,5.3.5.3,免疫筛选法,原理：抗原抗体特异性结合,适用于对表达文库的筛选,文库铺于,E.coli,形成噬菌斑,转移到硝酸纤维素膜,保存原板加入一抗筛选膜上的噬菌斑印记,吸收,噬菌体中表达的外源蛋白,洗去未结合的抗体加入酶偶联的二抗,E,加底物显色,从保存板中挑出阳性噬菌斑,0.0,34,5.3.5.3 免疫筛选法原理：抗原抗体特异性结合文库铺于E,