,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,Company Logo,*,单击此处编辑母版标题样式,L o g o,L o g o,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,Company Logo,培养基成分,高渗溶液（有机,/,无机）,缓冲液的,pH,（,5.8-7.4,）,酶解条件（时间,/,各种酶的比例）,酶液用高盐还是高渗缓冲液配,擦镜纸收集菌丝体,or,离心收集菌丝体,双层,or,单层培养基,Company Logo,微生物学实验教程,周德庆（酵母）,1,、接种于液体培养基上培养。,2,、取培养液,10ml,，,4000r/min,离心,5min,弃上清液，用,Tris-HCl(pH 7.4),、,0.5mol/LEDTA,、高渗缓冲液各洗涤一次。,3,、用含,10mmol/L,巯基乙醇的高渗缓冲液稀释裂解酶液。,4,、加酶液，,100r/min,摇床,50-100min,酶解。脱壁效果达,70%,左右即停止酶解。,5,、,100r/min,离心三分钟，去沉淀，取上清。再,2000r/min,离心,10min,收集沉淀原生质体。,6,、高渗缓冲液洗涤,2,次，,2000r/min,离心,10min,收集原生质体，最终用,1ml,高渗缓冲液悬浮原生质体。,高渗缓冲液：,蔗糖,0.5mol/L,MgCl,2,10mmol/L,Tris-HCl(pH 7.4)10mmol/L,Company Logo,1,、原生质体混合、,PEG,助融,2,、双层平板：底层,10ml,的固体培养基（,1.2%,琼脂），将样品加入,5ml,融化后的半固体培养基（,0.6%,琼脂，预保温,42,）中，快速混合，导入铺有底层培养基的平板上。待上层凝固后，置于恒温箱培养,Company Logo,工业微生物育种学,施巧琴 吴松刚,*菌丝培养基：,1,、葡萄糖蛋白胨培养基,2,、,PDA,培养基（一种普遍用于酵母菌和霉菌计数培养用的培养基，被推荐用于各类食品和饮料中酵母菌和霉菌检测和计数）,3,、査氏培养基（用于真菌的分离鉴定，霉菌、白色念珠菌、酵母等微生物）,*再生培养基：同查氏培养基，其中含,NaCl,浓度为,0.8mol/L,Company Logo,*缓冲液：磷酸氢二钠,-,柠檬酸溶液,*高渗溶液：,0.6mol/L NaCl,溶液,*酶溶液：蜗牛酶、纤维素酶，用,0.7mol/L,的,NaCl,配制，,G6,砂芯漏斗抽滤除菌,Company Logo,取,10,7,个,/mL,的单孢子悬浮液，涂布于平板表面的玻璃纸上，培养后用无菌镊子将培养菌丝体的玻璃纸转移并倒复在已配好的酶液内，轻轻抖动玻璃纸，菌丝体散落在酶液中，然后去玻璃纸，酶解，定时取样观察。,（该法收集的菌丝体会十分干净，免去了洗涤、离心等手续，减少对菌丝的伤害和杂菌污染）,酶解,1-2h,，将培养皿内破碎菌丝体和原生质体混合液用吸管吹吸数次，用,G2,或,G3,砂芯漏斗过滤，使原生质体同菌丝体碎片分开，滤液,1500-2000r/min,离心,10min,，洗涤去上清，悬浮于同一高渗溶液中。再将含有原生质体的滤液用再生培养基洗涤三次，以清除酶液，然后用保存液悬浮。血球计数板计数，冷藏备用。,双层平板，再生，计算原生质体再生率。,Company Logo,林艳学姐：,挑,Aspergillus oryzae,P5,菌丝于葡萄糖,-,蛋白胨斜面培养基上培养,67,天，至孢子成黄绿色,取新鲜培养的斜面,7,支，用,20mL,无菌水洗下成熟孢子于铺满玻璃珠的三角瓶中，置摇床上,150r/min,振荡分散,30min,经四层无菌镜头纸过滤，制成孢子浓度约为,10,7,个,/mL,的单孢子悬浮液,将上述制得的孢子悬浮液每,1mL,接种于一瓶盛有,50mL,菌丝培养基的三角瓶中，于,30,静止培养,2325h,6000r/min,，离心,10min,收集幼嫩的菌丝体,用无菌水洗涤菌丝体，,4000r/min,，离心,5min,收集菌丝体,用,PBA,溶液洗涤菌丝体两次，每次,4000r/min,，离心,5min,收集菌丝体,Company Logo,以,0.15g,湿菌体用酶量,1mL,的比例，加入酶液，置于灭菌平板中,置,33,摇床上,80r/min,振荡酶解，每半小时取样，在显微镜下观察原生质体的释放情况,待酶解完全后，加等体积,1mol/L,山梨醇溶液，用四层无菌镜头纸过滤，除去未酶解的菌丝体残片，收集原生质体液,4000r/min,室温离心,10min,，收集原生质体沉淀,去上清，沉淀用,1mol/L,山梨醇溶液洗涤,2,次，每次,4000r/min,离心,10min,弃上清将原生质体悬浮于,5mL 1mol/L,山梨醇溶液中，,-70,冰箱冷冻保存备用,Company Logo,将制备好的原生质体溶液,3200r/min,，,4,离心,10min,；,弃上清，沉淀重悬于预冷的,STC,溶液中，将原生质体浓度调整为,510,6,510,7,个细胞,/mL,；,将约,25g,质粒,DNA(,体积不超过,10L),与,100L,米曲霉原生质体置冰上轻轻混匀；,加入,25L PTC,溶液，冰浴,20min,；,加入,1 mL PTC,溶液，室温放置,15min,；,最后加入,2mL STC,溶液，混匀。,将适量上述转化液涂布于高渗再生基本培养基上，,30,培养,57,天，所长出的菌落即为转化成功的菌株；同时设置未加质粒而转化的原生质体涂布平板作为阴性对照。,Company Logo,菌丝培养基,葡萄糖含量为,0.5%,的葡萄糖,-,蛋白胨完全培养基。,高渗再生培养基,以,1.2mol/L Sorbitol,（山梨糖醇）配制的葡萄糖,-,蛋白胨基本固体培养基。,0.2 mol/L,磷酸缓冲液（,pH6.0,）：,0.2 mol/L NaH,2,PO,4,2H,2,O,（约,240mL,）和,0.2 mol/L Na,2,HPO,4,12H,2,O,（约,60mL,）混合至,pH,为,6.0,Company Logo,混合酶液：,2%,纤维素酶，,1%,蜗牛酶，,5mmol/L,二硫苏糖醇（,DTT,）用,pH6.0,的含,0.4 mol/L NH,4,Cl,的,0.2mol/L,磷酸缓冲液配置混合酶液，经,0.45m,微孔滤膜过滤除菌，保存于,4,PTC,溶液：,25%PEG8000,，,50mmol/L CaCl,2,，,10mmol/L Tris-HCl(pH 7.5),STC,溶液：,1.2mol/L Sorbitol,，,50mmol/L CaCl,2,，,10mmol/L Tris-HCl(pH 7.5),Company Logo,1.,米曲霉,C-2,在,2%G-P,斜面培养,6,天至长出孢子，灭菌去离子水洗下孢子，经四层擦镜纸过滤制成孢子悬液，接种于,50mL 0.5%G-P,菌丝全培养基，,30,静置培养,2325h,；,2.,过滤收集菌体，用无菌水与,0.8M NaCl,各洗涤一次；,3.,菌体置于灭菌培养皿中，加入,15ml,酶解液（,2%,纤维素酶、,1%,蜗牛酶、,3mM DTT,）；,4.,置,30,摇床（,80r/min,）酶解,3h,左右，在显微镜下观察原生质体的释放情况；,5.,酶解完全后，四层擦镜纸过滤，除去未酶解菌丝，离心收集原生质体；,6.,用,0.8M NaCl,洗涤二次，,0.8M NaCl-50mM CaCl,2,洗涤一次；,7.,弃上清原生质体重悬于,100L 0.8M NaCl-50mM CaCl,2,中，血球板计数。,王金良学长：,Company Logo,1,、将构建的,pMD-,pyrG,质粒与,100L,原生质体置冰上轻轻混匀；,加入,25L,预冷,PTC,，冰浴,30 min,；,2,、再加入,500L,上述,PTC,溶液，平静混匀，室温,20min,；,加入预冷,1mL 0.8M NaCl-50mM CaCl,2,，混匀；,3,、与,100mL,米曲霉高渗再生培养基混合，倒平板；,30,培养,4-7,天。,Company Logo,培养基成分,高渗溶液（有机,/,无机）,缓冲液的,pH,（,5.8-7.4,）,酶解条件（时间,/,各种酶的比例）,酶液用高盐还是高渗缓冲液配,擦镜纸收集菌丝体,or,离心收集菌丝体,双层,or,单层培养基,Company Logo,取培养,20h,的康氏木霉菌丝体悬液,10mL,，,4000r/min,离心,30min,收集菌丝体，用无菌水,4000r/min,离心,30min,洗涤,2,次，加,2.0%,蜗牛酶溶液,30,水浴酶解至原生质体形成率接近,100%,时停止酶解，用,0.6mol/L NaCl 5min,条件下离心洗涤,2,次，最后将原生质体悬于,0.6mol/L NaCl,溶液中。,在原生质体制备过程中每隔一定时间取酶解液制成水封片于显微镜下观察。,Company Logo,取原生质体悬液,1mL,与,5mL,上层再生培养基混匀，倾倒于下层再生培养基平板上，待培养基凝固后于,28,培养箱中倒置培养。用下式计算再生率：,再生率（,%,）,=,（,A-B,）,/C100%,式中：,A,为经高渗溶液稀释的原生质体在再生培养基上长出的菌落数；,B,为经无菌水稀释的原生质体在再生培养基上长出的菌落数；,C,为显微镜下计数的原生质体数。,Company Logo,培养时间,22h,酶种类和浓度,单一蜗牛酶，,3%,酶解时间,2.5h,酶解温度,36,渗透压稳定剂,无机盐溶液有利于原生质体的释放，而糖醇类不利于原生质体释放（,NaCl,）,原生质体制备,Company Logo,原生质体再生,酶种类和浓度,单一蜗牛酶，,2%,酶解温度,30,渗透压稳定剂,糖,醇类有利于原生质体的再生而无机盐类物质不利于再生（蔗糖）,再生培养基中蔗糖浓度,0.8mol/L,康氏木霉原生质体制备的最适菌龄为,22h,，蜗牛酶浓度为,2.0%,，酶解温度为,30,，酶解时间为,2.5h,，蜗牛酶溶液中的渗透压稳定剂为,0.6mol/L NaCl,，再生培养基中的渗透压稳定剂为,0.8mol/L,蔗糖,Company Logo,菌丝体培养,60 h,用,1.5%,溶菌酶,+0.5%,蜗牛酶混合酶液,pH,值,6.0,6.5,温度,30,35,酶解,4 h,以,0.7mol/L,甘露醇为稳渗剂,此条件下原生质体产量可达,1.68 10,7,个,/ml,。,PDA,再生培养基,稳渗剂为,0.5 mol/L,蔗糖,双层固体培养,此条件下原生质体再生率可达,6.05%,6.12%,Click to edit company slogan.,Thank You!,