单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,液态活检技术及其临床应用,传统的肿瘤诊断技术,传统肿瘤,诊断技术,病理检验诊断,影像学检测,病理组织检查（,HE,，,IHC,）,血清标志物,检测（,CEA,PSA),核磁共振成像,（,MRI,）,正电子成像术（,PET,-CT,）,X射线断层扫描术,（,XRAY,CT,）,超声波检测（B超）,内窥镜（Endoscope）,分子病理检测（,FISH,RT-PCR,NGS,）,传统的肿瘤诊断存在的问题,早期筛查,：,标记物不统一,方法不够灵敏或是特异性不足。,临床诊断,:,影像学：较灵敏，特异性不足，对病灶大小有要求。,病理学：金标准，但是需要组织样本，取样会带来创伤和扩散风险，很多晚期患者无法取样或取样不足。,治疗,/,复发转移监测,：,影像学：结果普遍存在滞后性。,血清标志物：较灵敏，但是特异性不足；有些类型癌症没有合适的血清标志物。,2015,年十大突破技术,-,液态活检技术,MIT Technology Review,杂志发布了,2015,年度十大突破技术,(10 Breakthrough Technologies 2015),的榜单。液态活检技术光荣上榜。,液态活检：快速、简便、无痛苦、无创伤的癌症血液检测方法,传统而又崭新的检测技术,-,“,液态活检,”,“液态活检”的定义：,A liquid biopsy is a liquid biomarker that can be easily isolated from many body fluids blood,saliva,urine,ascites,pleural effusion,etc.)and,as well as a tissue biopsy,a representative of the tissue from which it is spread.液体活检是一种液体生物标志物，可以容易地从许多体液中分离血液，唾液，尿液，腹水，胸腔积液等），以及组织活组织检查法，其是从其传播的组织的代表。,-Christian,Rolfo,Biochimica,et,Biophysica,Acta,2013.,“,液态活检,”,的标记物,CTCs,ctDNA,(,cfDNA,),主要指来自于抗凝的外周血全血，,完整的肿瘤细胞,主要指来自于抗凝血外周血的血浆，片段化的,DNA,片段,一般认为来源于肿瘤原发灶,/,转移灶,肿瘤瘤细胞凋亡,/,坏死释放的,DNA,片段,活细胞，一般不宜长期保存,提取纯化后的核酸，可以保存,可以用于细胞学形态、结构分析；也可以分析细胞,DNA,、,RNA,、蛋白质等各类标志物,一般用于,DNA,突变监测、甲基化等,DNA,修饰相关分析,用于病情评价、预后判断，肿瘤早期诊断潜力不明确,用于个体化治疗，肿瘤早期诊断潜力相对明确,还有,miRNAs,，,Peptides,，,Exosomes,（外泌体），,Secretomes,（分泌物质组）等。,ctDNA,（,circulating tumor DNA,），即循环肿瘤,DNA,，从字面意思来讲，指的是由肿瘤细胞释放到血液循环系统中的,DNA,。但是在了解,ctDNA,之前，我们要知道另一个与之相关的概念,cfDNA,。,cfDNA,（,cell-free DNA,），或者叫血浆游离,DNA,，是血浆中游离存在的,DNA,，它们有的来自于正常细胞，有的来自于异常细胞（如肿瘤细胞），还有部分来自于我们外部（如病毒,DNA,）。,来源：,1,、来自于坏死的肿瘤细胞,2,、来自于凋亡的肿瘤细胞,3,、来自于肿瘤细胞分泌的外排物,什么是,ctDNA,?,早在,1947,年，,Mandel,和,Metais,就发现血浆中存在游离的核酸分子。,1977,年，,Leon,等人发现，肿瘤患者的血浆游离,DNA,水平要明显高于健康人群,又过了,17,年，人们才发现这种携带了突变信息的循环,DNA,是肿瘤的标志,人们逐渐明白，,cfDNA,中 携带肿瘤特有突变的那一小部分,DNA,，确确实实是由肿瘤细胞释放出来的，,ctDNA,的研究终于与肿瘤关联起来。,ctDNA,的发现,在几乎所有种类的癌症中，都检测到了,ctDNA,所带有的标志性突变，并且肿瘤越晚期，病情越严重，肿瘤的恶性程度越高，,ctDNA,特有突变的频率就越高。一项针对,15,种癌症进行的,ctDNA,测序研究显示，分别有,47%,，,55%,，,69%,，,82%,的,I-IV,期癌症病人中能检测到高于一定频率的,ctDNA,突变；而另一项使用更高灵敏度测序技术的研究则表示，对于,II,期以上的病人，均能,100%,检测到突变。,不同分期癌症的,ctDNA,检出情况,不同癌症种类的,ctDNA,检出情况,CtDNA,临床应用领域,CtDNA,作为一种新的肿瘤标志物，将在肿瘤的诊断、治疗及预后检测等方面发挥重要的作用，尤其是对于一些不具有典型临床症状、检查无特异性和诊断困难的肿瘤可避免复杂的、具有创伤性的活检。,ctDNA,来自肿瘤细胞的体细胞突变，不同于遗传突变的是，遗传突变存在于体内每个细胞。因此，,ctDNA,是一种特征性的肿瘤生物标记物，并且还可以被定性、定量和追踪。,检测,9,名接受特罗凯一线治疗的,NSCLC,患者血浆中,ctDNA,的,EGFR,突变情况，一直到患者进展至,PD,。,在接受治疗后，所有患者血浆中的含有,EGFR,突变的,ctDNA,浓度出现下降，其中,8,人的,EGFR,突变完全消失。,有,6,名患者的血浆中重新检测到,EGFR,突变的时间要比进展至,PD,的时间早,4,个月以上！随着治疗，所有,9,名患者的血浆中均检出一定量,T790M,突变。,血浆中没有检测到,EGFR,的,3,名患者，进展至,PD,期时，其肿瘤仅在胸腔内有缓慢进展。,利用,NSCLC,癌患者血浆中的,ctDNA,检测,EGFR,突变,现有技术用石蜡组织切片样本只能检测,60copies,以上的突变含量，但是用液态活检通过数字,PCR,平台却可以检测,0-60copies,之间的突变含量，更早的发现病情及耐药性，对于癌症患者如果能提前,4,个月发现病情的变化，生存率会大大提高。,-,Clin,Cancer Res,2014,march,著名的,JohnsHopkins,大学最近的一项研究揭示了,ctDNA,的真面目，它其实是一种具备广泛应用前景、高敏感性、高特异性的肿瘤标志物，,-,Nature Medicine,2014,May,研究者还在不同级别的肺癌患者中对,CAPP-Seq,进行了验证，发现,II-IV,期的,NSCLC,中检测敏感性,100%,，,I,期的,NSCLC,中敏感性为,50%,，而且在各期的肺癌中的特异性均在,96%,。在,II-IV,期和所有分期的肺癌中，根据,ROC,曲线计算出的,AUC,分别为,0.99,和,0.95,，所以,CAPP-Seq,具有强大的检测能力。临床资料表明，,ctDNA,比例低至,0.019%,的时候也还能够被,CAPP-Seq,检测到。,研究者用,CAPP-Seq,测定的,ctDNA,的水平和肿瘤体积（肿瘤体积用,CT,和,PET,评估测定）之间存在显著相关性（,p=0.0002,，,R2=0.89,），除了几例,I,期肺癌患者的肿瘤体积明显高于其,ctDNA,相对应的大小。随访研究发现,ctDNA,水平随着疾病进展和相应的治疗，也在不断变化。对,10,例样本（,7,例阳性和,3,例阴性）进行了肿瘤标本（侵入性的活检）和血液标本（非侵入性的,CAPP-Seq,检测）在筛查和基因型（,EGFR,和,KRAS,）检测中的对比，结果发现,CAPP-Seq,并不比金标准肿瘤活检的检测效能差，能够准确测定肺癌的基因型。,ctDNA,中,PI3KCA,的检测可用于预测,原发性乳腺癌患者的预后,1.,ctDNA,有,PI3KCA,检出的乳腺癌患者，其预后要比没有检出的患者差。,-,Breast Cancer Res Treat,，,2015,，,March,2.,ctDNA,中,PI3KCA,拷贝数高的乳腺癌患者，其预后要比拷贝数低的患者差。,循环肿瘤细胞指从实体瘤中脱离出来并进入外周血液循环的肿瘤细胞。,CTC,形成、播散及转移的模式图,原发肿瘤血管生成侵润,侵入血管内,侵入血管外,(CTC),血管内增殖,(CTM),转移,转移,播散肿瘤细胞（,DTC,）微转移休眠灶,循环肿瘤细胞（,CTC,）,循环肿瘤,微栓,（,CTM,）,凋亡的,CTC,侵润,肿瘤细胞,扩增,血管生成,上皮间质转化,（,EMT,）,间质上皮转化,（ME,T,）,转移到骨髓和其他器官,17,CTC,的稀有性和异质性,Cancers,2013,；,Nature,Review of Clinical Oncology,2010,CTC,的临床应用方向,CTC,检测,6,、指导,用药,3,、术后,监控,1,、预后,评估,2,、疗效监测,5,、早期筛查,4,、辅助诊断,用两种不同的方法检测,CTC,以评估,非小细胞肺癌患者的预后,1.ISET,法检出率为,104/210(50%),，,CellSearch,法检出率为,82/210(39%),，两种方法检出,CTC,的患者的,DFS,均明显劣于无,CTC,检出的患者。,2.ISET,法检出,23/210,（,11%,）的患者外周血中含有间质化的,CTC,细胞，这种细胞通常意味着更强的侵袭性。,ISET,法和,CellSearch,法可以作为,CTC,检测的互补的方法，两种方法单独或者联合使用都可以用于检测,CTC,，以评估肺癌手术的预后。,-,Int.J.Cancer,，,2011,，,Vol129,放疗前，,65%,患者检出,CTC,，平均检出率,9.1CTCs/ml,，明显高于放疗后的,CTC,平均数（,0.6,个）。有,1,名在放疗后,CTC,明显未降低的患者，出现远端转移。,-,Cancer J,，,2015,，,121(1,),通过检测非小细胞肺癌患者的外周血中,循环肿瘤细胞评价放疗疗效,CTC可作为慢性阻塞性肺炎（COPD）患者,肺癌早期诊断的新的标志物,21,Hofman,P.,，,PLoS,One,，,2014,，,Vol9,（,10,）,分类,COPD,患者,吸烟者,健康人,检测结果,CTC+,CTC-,CTC-,CTC-,人数,5,163,42,35,当时是否检测出癌症,No,No,No,No,5,年内检测出癌症,Yes,(5/5),No,No,No,CTC,v.s,.,ctDNA,互相排斥还是互为补充？,1.,可能来源于非肿瘤组织，特异性低；,2.,血浆中含量较丰富，检测方法简便；,3.,来自多个细胞的更全面的遗传信息，但一般来自于凋亡的肿瘤细胞；,4.,ctDNA,用于实时监测乳腺癌等疾病的进展和疗效时，灵敏度更高；,5.,因为不含特异性突变，,ctDNA,不适用于某些癌症的检测，比如肾癌。,V.S.,1.,细胞形态结合分子标记，特异性高；,2.,血液中数量稀少，检测,难度大；,3.,只能代表肿瘤细胞的部分亚群，但是是最有侵袭性的一部分细胞；,4.,反向选择的,CTCs,检测适用于大多数癌症种类，但有些癌症检出率太低。,5.,完整的有活性的肿瘤细胞个体，能检测对药物的反应；可以提供新的肿瘤治疗靶点，可以帮助理解肿瘤,转移的机制。,CTCs,CtDNA,CTCs,与,ctDNA,检测的有机结合才是未来的方向！,ctDNA,及,CTC,检测与,NSCLC,的靶向治疗疗效的相关性,检测,EGFR,突变时，,ctDNA,比,CTCs,更为灵敏，而且与原位肿瘤的一致性更高。,-,Clin,Cancer Res,，,2012,，,April,2.CTC,数量的减少更适宜用于作为快速评价疗效反应的标记物。,文章主要通过数字,PCR,比较,CtDNA,、肿瘤标记物,及,循环肿瘤细胞,三个方