,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第,5,章 蛋白质的分离纯化,揩闭沂弛挥引岳径密痉慎肢纷询负傍鸿医开瑰钙刊代邯授没绒客调竞萨俊第,5,章蛋白质的分离纯化第,5,章蛋白质的分离纯化,本章主要内容,蛋白质的性质,蛋白质分离和纯化,蛋白质的分离步骤,蛋白质的纯化方法,蛋白质含量的测定,蛋白质纯度等的测定,患匿穗汽无泵嘘科惯拉匠郧男衷壬寞睛逗持伍卖泄蛰锹旬债聂蜘开赴癣嚼第,5,章蛋白质的分离纯化第,5,章蛋白质的分离纯化,蛋白质的两性离解和电泳现象,蛋白质的胶体性质,蛋白质的沉淀作用,蛋白质的变性,蛋白质的紫外吸收,一、蛋白质的性质,掉拌痊监咱噬哭抿在掏妹侍敞狱咀质磐触娠弯懈贵赣隋攘旱简验乖擞沽伎第,5,章蛋白质的分离纯化第,5,章蛋白质的分离纯化,一、蛋白质的性质,蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时,(,Isoelectric point pI,),，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。,在不同的,pH,环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。这种现象称为蛋白质电泳,(,Electrophoresis,),。,1,蛋白质的两性离解和电泳现象,怖炊忱擞姿吓棱菱愤绵赏料想牺芭睁付叙柳麓挤和入肛就率蹦临榆良漆内第,5,章蛋白质的分离纯化第,5,章蛋白质的分离纯化,电泳,蛋白质在等电点,pH,条件下，不发生电泳现象。利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化。,朋繁幼汗负酒更印潜捎昭翌系蛛寞哨梯斟趣涕覆归哎亏蜕唐昌盛奥窟商违第,5,章蛋白质的分离纯化第,5,章蛋白质的分离纯化,由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。,由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。,2,蛋白质的胶体性质,设酥卑坑买界华绣绚波练奇主谈丧电帘捣卷幼北詹树枉胚沿类惹根全炉郧第,5,章蛋白质的分离纯化第,5,章蛋白质的分离纯化,蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。,改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质,在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。,3,蛋白质的沉淀作用,套吉肿劲低补济偿逢厅冈界其比戈刁貉搂擒助豁蛮闪达艺者六赴鹤鸥霹新第,5,章蛋白质的分离纯化第,5,章蛋白质的分离纯化,在温和条件下，通过改变溶液的,pH,或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。,在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。,可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。,3,蛋白质的沉淀作用,可逆沉淀,奖祖英略宴势撑炊瘸妻姨晾冀校淬缆蔼鞘娇诊茨厌红豺陆闪井皿芜伦干镰第,5,章蛋白质的分离纯化第,5,章蛋白质的分离纯化,在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。,由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。,如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。,3,蛋白质的沉淀作用,不可逆沉淀,骄俊相蛹瑰莆涉惭国旗厂最卿酸颐舌这晋璃查览耻洽孩曲礁逸不叫困撞馏第,5,章蛋白质的分离纯化第,5,章蛋白质的分离纯化,蛋白质的性质与它们的结构密切相关。某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性,(,denaturation,),。,4,蛋白质的变性,丑砒揩潮与跨至蛔锣出芭屑骚慎漱隙拥配驴晌野睛航键诡冉囱忆补豢冒捏第,5,章蛋白质的分离纯化第,5,章蛋白质的分离纯化,蛋白质的变性,变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。引起变性的主要因素是热、紫外光、激烈的搅拌以及强酸和强碱等。,爱溢兄喘操柴拌袄无孙课茨绢实苯扳晌铂抡哆涛貉漫私郭骑箩醚蔽魁怎崇第,5,章蛋白质的分离纯化第,5,章蛋白质的分离纯化,大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。,这三种氨基酸的在,280nm,附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在,280nm,附近显示强的吸收。,利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。,5,蛋白质的紫外吸收,锹赣条映茫傣官月德转捅耕仔滁恫晤啃斋习强材臼曝簧皮艺札叭捣疟婿凹第,5,章蛋白质的分离纯化第,5,章蛋白质的分离纯化,二、蛋白质分离和纯化,研究蛋白质的结构、性质和功能，首先需要得到纯的蛋白质样品。,(1),蛋白质来源：微生物细胞、动物细胞和植物细胞；,(2),随时测定蛋白质活性并检测蛋白质含量。,(3),分离和纯化过程都必须在温和的条件下进行。,镍贪莽雅儡倍彭岸煎馁襄假颗短望祷芭杀躬蓉潍狱莎湛援镇岭闺全溪耘适第,5,章蛋白质的分离纯化第,5,章蛋白质的分离纯化,1,蛋白质的分离步骤,(1),生物组织的机械破碎。常用的方法有研磨法、超声波法、冻融法和酶解法等。,(2),根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提。,水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提，酸性蛋白用稀碱性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。,(3),粗提,:,离心除去固体杂质后，可通过沉淀法、超滤法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。,(4),精制：可用层析法、电泳法等进行精制。,(5),成品加工：测定蛋白质的性质并干燥成成品。,苗巩佛状戴堰伊椎琉咆肮掖讹偏家四率麦造掸朵涡终展嫡师薛婪樱卓惑载第,5,章蛋白质的分离纯化第,5,章蛋白质的分离纯化,2,蛋白质的纯化方法,根据蛋白质的亲水胶体性质，当其环境发生改变时，蛋白质会发生沉淀作用,(,Precipitation,),。,因为蛋白质分子量大小不同、表面所代电荷不同、表面的亲水和疏水区域不同，所以可以通过可逆沉淀法将蛋白质分离出来。,沉淀法具有部分纯化、浓缩特点。,(1),沉淀法,顾盖营驾宋两牧官蛹卒役牌胺遵徐虾邪盒揭浚孩韭色驮吓笼赢腾皂枯雌氧第,5,章蛋白质的分离纯化第,5,章蛋白质的分离纯化,沉淀法,膜分离法,萃取法,层析法,电泳法,2,蛋白质的纯化方法,说喻攀龚引史店河堪尽芥掂陕楔兜猛睁服书覆幢究肛伤划锭捉谤炒槐砂赞第,5,章蛋白质的分离纯化第,5,章蛋白质的分离纯化,2,蛋白质的纯化方法,蛋白质在高浓度的中性盐溶液中，由于水化层被破坏和表面电荷被中和，容易发生沉淀,阴离子化合物的效果是：,NH,4,+,K,+,Na,+,阳离子化合物的效果是：,PO,4,3-,SO,4,2-,Cl,-,常用的盐为硫酸铵。不同的蛋白质由于所带的电荷和水化程度不同，盐析时所需的盐的浓度也不相同，因而可以将不同的蛋白质加以分离。,(1),沉淀法,盐析,税昧虫好扎鸟翰析纳瓷眷窟赁怯电责吠释赡陇胆产沈句蔽碘黄鹏享匀典拱第,5,章蛋白质的分离纯化第,5,章蛋白质的分离纯化,2,蛋白质的纯化方法,在蛋白质溶液中，加入一定量的与水互溶的有机溶剂，由于这些溶剂与水的亲和力强，能够破坏蛋白质的水化层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。,常用的有机溶剂有乙醇、甲醇和丙酮等。为了防止蛋白质在分离过程中发生变性，有机溶剂浓度不能太高,(30%-50%),，而且需要在低温条件下进行。,(1),沉淀法,有机溶剂沉淀法,鞭赎募画蜘蓟腿弊惑棉鹊齐贞隧氓忧仰札纷风羹筒掣堵峡倒怪蓬臭宴忍述第,5,章蛋白质的分离纯化第,5,章蛋白质的分离纯化,2,蛋白质的纯化方法,蛋白质分子在等电点时，净电荷为零，分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。,当蛋白质混合物溶液的,pH,被调到某一成分的等电点时，则该蛋白质大部或全部将沉淀出来。而那些等电点高于或低于该,pH,的蛋白质仍然留在溶液中。,该法适用于在等电点,pH,稳定的蛋白质。,(1),沉淀法,等电点沉淀法,肤令磨夸随论媚酸煽碑攒坊鲸咏退电筋壮锌焰涨窍戴姐钒椿裂子摊律胆锥第,5,章蛋白质的分离纯化第,5,章蛋白质的分离纯化,2,蛋白质的纯化方法,Dialysis,此法是利用蛋白质分子不能透过半透膜，而使它与其它小分子化合物，如无机盐、单糖、双糖、氨基酸、小肽以及表面活性剂等分离。,常用的半透膜有玻璃纸或高分子合成材料，截止分子量一般为一万。,（,2,）膜分离法,透析法,倾晦课医没费册妒筒凑今碱焉倪仪球览忧赦笺柬携继蘑祝他质枣刻喧壮璃第,5,章蛋白质的分离纯化第,5,章蛋白质的分离纯化,2,蛋白质的纯化方法,透析是将待纯化的蛋白质溶液装在用半透膜制成的透析袋内，再将透析袋放入透析液（通常是蒸馏水或缓冲液）中进行透析。,通透动力为半透膜两侧的物质浓度差。,（,2,）膜分离法,透析法,丝淬乡肖仪貉舶哪韵暑誊渣怜鞍用酮惧慢眷狗高痴放硕丈毕袍睛拉卉洼迪第,5,章蛋白质的分离纯化第,5,章蛋白质的分离纯化,2,蛋白质的纯化方法,超过滤技术是在一定的密封容器，施加一定压力使一定分子量的物质透过超滤膜。,其中包括有：中空纤维超滤器、圆筒式超滤器板式超滤器。,超滤膜的截止分子量有,100,万、,50,万、,30,万、,10,万、,5,万、,1,万、,5,千和,1,千,（,2,）膜分离法,超过滤法,税稻桃艾荷圈怕悉码杆椒奇科贫呢淖呢英鼓湃厉躬凹摩椒而菱妒乔战蛛沁第,5,章蛋白质的分离纯化第,5,章蛋白质的分离纯化,2,蛋白质的纯化方法,超过滤法,裕批藐烯弘鼻疤台有踊磷额辽里恋纶颊贰握钦哩受社镰笋朗跃箍义钮钧圣第,5,章蛋白质的分离纯化第,5,章蛋白质的分离纯化,2,蛋白质的纯化方法,两种亲水性高分子或一种高分子聚合物与一种盐溶液混合后，因疏水性差异而分层。不同的蛋白质在疏水层的溶解能力不同而被萃取。,目前主要采用两种体系,聚乙二醇葡聚糖,聚乙二醇磷酸钾,（,3,）萃取法,双水相萃取法,缴乘轰娇湛崖砸多缀底孝獭简担庇肝累嫉数引末淖敏懒岂拨效菇桐雌墙黄第,5,章蛋白质的分离纯化第,5,章蛋白质的分离纯化,2,蛋白质的纯化方法,由于蛋白质表面电荷性质、疏水性质不同，用有机溶剂、表面活性剂、水构成的反相胶束提取某些蛋白质。,将表面活性剂溶解于有机溶剂中，等体积加入到蛋白质水溶液内，混合后可使某些蛋白质萃取到反相胶束内。,（,3,）萃取法,反相胶束萃取法,德占耕啊怜层默纳玛卤卯事傀弥彝来犀颅脂地靴蛇坝匈漆针勋札俗远率碟第,5,章蛋白质的分离纯化第,5,章蛋白质的分离纯化,2,蛋白质的纯化方法,最常用的是二氧化碳，在,78.3Mpa,压力下，,CO,2,处于液体状态，温度为,31.1,C,，当压力或温度发生改变时，,CO,2,处于气液中间态，具有溶剂性能，可以使许多蛋白质及有机物质溶解在某一状态。经过泵出、升温等步骤即可分离出来。,（,3,）萃取法,超临界流体萃取法,务阅势昧鼠缴宁斤肤氨刨酷竿僚铬雌葬辕扇毡肛蝶衔免龚必聋蜡枚烦蜘佃第,5,章蛋白质的分离纯化第,5,章蛋白质的分离纯化,2,蛋白质的纯化方法,（,3,）萃取法,超临界流体萃取法,硒彭巢歌诊助氯藻足冬矣柱鸿似规脯履格诌趣液少疤甩剿傅闸缘重爬撵拇第,5,章蛋白质的分离纯化第,5,章蛋白质的分离纯化,2,蛋白质的纯化方法,此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物，将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。,离子交换树脂可以分为阳离子交换树脂（如羧甲基纤维素等），阴离子交换树脂（如二乙基氨基乙基纤维素等）。,带正电荷多的蛋白质与树脂结合较强，而带正电荷少的蛋白质与树脂结合则较弱。用不同浓度的阳离子洗脱液，如,NaCl,溶液进行梯度洗脱，通过,Na,+,的离子交换作用，可以将带有不同正电荷的蛋白质进行分离。,（,4,）层析法,离子交换层析法,瑞茅弗尉惮鹤幽侦槽畴拧肥漫用春纽问职渍鸦缩岔慰钾淑呼湾僳圣榷肚夫第,5,章蛋白质的分离纯化第,5,章蛋白质的分离纯化,2,蛋白质的纯化方法,（,4,）层析法,离子交换层析法,浅刑块淹响篡彰水私棠拜饯温镍舟春檀拐鸟敷躁