,*,*,单击此处编辑母版标题样式,*,实验,23,琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶,实验,23,琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶,实验目的,掌握：,电泳法测定血清乳酸脱氢酶同工酶的基本原理。,熟悉：,电泳法分离血清乳酸脱氢酶同工酶的的操作过程、注意事项及对疾病诊断的临床意义。,了解：,琼脂糖凝胶电泳的临床应用。,乳酸脱氢酶同工酶的一级结构和等电点不同，在一定的电泳条件下，使其在支持介质上分离。然后利用酶的催化反应进行显色：,实验原理,1,巴比妥缓冲液（,pH 8.6,，离子强度,0.075,）,2,0.082mol/L,巴比妥,-,盐酸缓冲液（,pH 8.2,）,3,10mmol/L,乙二胺四乙酸二钠,4,5g/L,缓冲琼脂糖凝胶,5,8g/L,缓冲琼脂糖凝胶,6,显色试剂,7,固定漂洗液,试剂与器材,1,制备琼脂糖凝胶玻片,2,加样 用微量加样器加约,40l,血清于槽内。,3,电泳 电压,75V,100V,，电泳,30min,40min,。,4,显色,5,固定和漂洗,操作步骤,1,目视观察,在碱性介质中，,LD,同工酶电泳条带由正极到负极依次为：,LD1,、,LD2,、,LD3,、,LD4,和,LD5,。按各区带呈色的深浅，比较,LD,各同工酶区带呈色强度的关系。,2,光密度计扫描,用光密度计在,570nm,波长下扫描，求出各同工酶区带吸光度所占百分比。,结果观察,3,在不具备光密度仪扫描条件下，如果需要进行,定量,，可将各区带切开，分别装入试管中，加入,400 g/L,尿素,4ml,，于沸水浴中加温,5 min,10min,，取出冷却后以,570nm,波长比色。,空白管则取大小相同但无同工酶区带的凝胶，用上述相同的方法处理。,比色后根据各管吸光度计算各同工酶的百分率。,结果观察,吸光度总和：,A,总,A1+A2+A3+A4+A5,，,式中,A1,、,A2,、,A3,、,A4,、,A5,为各同工酶区带的吸光度,各同工酶百分率,(%),为：,(x=1,，,2,，,3,，,4,，,5),计算,健康成年人血清中,LD,同工酶百分比,有下述规律：,LD2,LD1,LD3,LD4,LD5,。,参考范围,1.LD,同工酶电泳分析在临床上常用于急性心肌梗死的诊断，在急性心肌梗死时,LD1,与,LD2,活性均升高，但,LD1,升高更早、更明显，导致,LD1/LD2,比值增大,。,2.,溶血性疾病、幼红细胞贫血症、肾坏死、以及假性肥大性肌营养不良、活动性风湿性心肌炎、急性病毒性心肌炎患者血清,LD1,和,LD2,的活性也可增高,。,临床意义,3.,肝炎、急性肝细胞损伤时,LD5,增高。急性肺损伤、白血病、胶原病、心包炎以及病毒感染时,LD2,和,LD3,增高,。,4.,胃癌、结肠癌和胰腺癌患者血清中五种,LD,同工酶均可升高，但,以,LD3,增高最为显著,。骨骼肌损伤时,LD4,和,LD5,增高,。,临床意义,1,严禁溶血。,2,LD4,与,LD5,（尤其是,LD5,）对热很敏感，因此底物,-,显色液的温度不能超过,50,，否则易使,LD5,等变性失活。,3,LD4,和,LD5,对冷不稳定，容易失活，应采用新鲜标本测定。如果需要，血清应放置于,25,条件下保存，一般可保存,2d,3d,。,4,PMS,对光敏感，故底物显色液需避光保存，否则显色后凝胶板背景颜色较深。,注意事项,操作简便、重复性好、标本用量少。,明显的溶血会导致假阳性。,评价,1,LD,同工酶测定时为什么要严禁溶血？为何测定,LD,的血清标本不能冰冻或冷藏？,2,LD,同工酶测定对疾病诊断的临床意义为何优于,LD,总活性测定？,3,LD,同工酶琼脂糖电泳测定的原理是什么？在电泳中应注意哪些事项？,思考题,