单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,天然生化物质制备大实验,Experiments of Preperation of Natural Biochemical products,可再生资源利用与加工实验教学中心,主 讲：吴石金 副教授,天然生化物质制备大实验可再生资源利用与加工实验教学中心 主,1,血清,球蛋白的分离、纯化及鉴定,1,动物内脏Cyt-c的制备及测定,2,从番茄酱中提取番茄红素和,-胡萝卜素,3,虎杖中羟基蒽醌的提取、分离与鉴定,4,天然生化物质制备,系列大实验,血清球蛋白的分离、纯化及鉴定1动物内脏Cyt-c的制备及,2,天然,生化物质制备技术路线,生物材料的选择,细胞及组织的破碎,生物分子的提取,生物分子的浓缩,天然生化物质制备技术路线生物材料的选择 细胞及,3,实验二,Cyt-c,的制备及测定,实验二Cyt-c的制备及测定,4,.通过Cyt-c 的制备，了解蛋白质制品制备的一般原理和步骤。,.掌握制备Cyt-c的操作技术及含量测定方法。,一、目的要求,.通过Cyt-c 的制备，了解蛋白质制品制备的一般原理和,5,细胞色素c（Cyt-c）,它是电子传递链中一个独立的蛋白质电子载体，位于线粒体内膜外表，属于膜周蛋白，易溶于水。它与细胞色素c,1,含有相同的辅基，但是蛋白组成则有所不同。在电子传递过程中，Cyt.c通过Fe,3+,Fe,2+,的互变起电子传递中间体作用。,胞液侧,基质侧,线粒体内膜,Q,1/2O,2,+,2H,+,H,2,O,延胡索酸,琥珀酸,e,-,Cytc,e,-,e,-,e,-,e,-,NAD,H,+,H,+,NAD,+,细胞色素c（Cyt-c）它是电子传递链中一个独立的蛋白质电,6,细胞色素c（Cyt-c）,Cyt-c,2e,-,内膜,外,内,细胞色素c（Cyt-c）Cyt-c2e-内膜外内,7,二、实验原理,Cyt-c存在于线粒体中，心肌和酵母细胞中含量丰富。,含铁卟啉的结合蛋白质，分子量约为13000；蛋白质部分由104个左右的氨基酸残基组成，赖氨酸含量较高，pI10.7。,是一种稳定的可溶性蛋白，它易溶于水及酸性溶液，故常用酸性水提取。,分氧化型和还原型两种，氧化型水溶液呈深红色，还原型呈桃红色。,对热较稳定，不易变性。,二、实验原理 Cyt-c存在于线粒体中，心肌和酵母细胞中含,8,氧化型Cyt-c在550nm下摩尔吸收系数为0.910,，,还原型Cyt-c为2.7710,。根据已知的摩尔吸收系数，可用,分光光度法测定Cyt-c的含量,。,摩尔吸收系数()：是指物质在 1mol/L 的浓度下，比色杯厚度为 1cm 时的吸光度。,：吸光度,：每升溶液中物质的摩尔数,：比色杯内径,二、实验原理,氧化型Cyt-c在550nm下摩尔吸收系数为0.910,9,以屠宰场新鲜猪内脏为原料，经过酸溶液提取，人造沸石吸附及三氯乙酸沉淀得到,Cyt-c,粗品。然后再用柱层析法将粗制品纯化，得精制品。,二、实验原理,以屠宰场新鲜猪内脏为原料，经过酸溶液提取，人造沸石吸附及三,10,三、试剂和器材,猪内脏,人造沸石，透析袋，树脂，三氯乙酸，NH,4,OH(氨水)，HCl，NaCl，,(NH,4,),2,SO,4,，BaCl,2,，K,3,Fe(CN),6,，连二亚硫酸钠，Na,2,HPO,4,，蒸馏水。,三、试剂和器材猪内脏,11,四、操作方法,取50 g猪心去结缔组织绞碎放入烧杯,加50 ml 0.145 mol/L三氯乙酸,4玻棒搅拌浸提2 h,4层纱布过滤,用 1 mol/L NH,4,OH调pH6,四、操作方法取50 g猪心去结缔组织绞碎放入烧杯,12,用 1 mol/L NH,4,OH调pH6,滤纸过滤，取滤液,用1mol/L NH,4,OH调pH7.2,按 6g/100 ml 取沸石加入,搅拌1 h,待沸石变红后弃上清,四、操作方法,用 1 mol/L NH4OH调pH6四、操作方法,13,四、操作方法,待沸石变红后弃上清,用100 ml H,2,O洗3次,用100 ml 0.2%NaCl洗3次,待上清液澄清弃上清,用25%(NH,4,),2,SO,4,每次10ml反复洗脱,至沸石变白，合并洗脱液,四、操作方法待沸石变红后弃上清,14,四、操作方法,按每100 ml洗脱液加25g固体(NH,4,),2,SO,4,溶解后以3000 rpm离心10 min,收集上清液,加40%三氯乙酸直至产生絮状沉淀（每100 ml细胞色素c液加2.5 ml,-,5 ml三氯乙酸）,3000 rpm离心15 min,取沉淀即细胞色素粗提物,四、操作方法按每100 ml洗脱液加25g固体(NH4)2S,15,四、操作方法,取沉淀即细胞色素粗提物,用1ml H,2,O溶解细胞色素c,于透析袋中透析过夜,用BaCl,2,检查透析是否完全,回收透析完全的细胞色素c液备用,四、操作方法取沉淀即细胞色素粗提物,16,柱层析操作步骤,Sephadex G-50的准备,装柱15cm,加样与洗脱,凝胶的再生,柱层析操作步骤 Sephadex G-50的准备,17,Sephadex G-50的准备,称取Sephadex-50 1 g，置于三角烧瓶中，加蒸馏水60ml，于沸水浴中加热5小时（此为加热溶胀；如在室温溶胀，需放置4872小时）取出，待冷却至室温后装柱。,Sephadex G-50的准备 称取Sep,18,层析柱,（a）自制简易层祈柱（1玻璃管；2.橡皮塞；3尼龙网）；（b）普通商品柱；,（c）双底板层析柱（1.洗脱液进出口；2.多孔底板；3柱床；,4恒温水进口；5恒温水出口；6可调节的塞子）,装柱15,cm,层析柱 装柱15 cm,19,层析系统连接示意图,1密封橡皮塞；2恒压管，3，恒压瓶；4，层析流出液，5可调蜾旋夹；6.自动收集器；7.核酸一蛋白质检测仪,层析系统连接示意,20,BS100自动部分收集器安装圈,1.反全阀；2,.,换管臂；3,.,滴管；4，5换管臂固定螺丝；6.竖杆；7.竖杆囤定螓丝；8.报警板；9.试管；10.收集盘；11.时间选挥旋钮；12.时间选择固定螺钉；13.自动开关；14.指示灯；15.电源开关；16.换向开关(逆、顺)；17.手动开关,BS100自动部分收集器安装圈,21,加样与洗脱,1直接将样品加到层析床表面,2利用两种液体比重不同而分层的原理，将高比重样品加入床表面低比重的洗脱液之中，样品就慢慢均匀地下沉于床表面，再打开出口，使样品渗入层析。,3.可用微量泵控制,加样与洗脱1直接将样品加到层析床表面 2利用两种液体比,22,流速对洗脱曲线的影响,流速较低，分辨率较高，样品稀释较轻。,流速对洗脱曲线的影响,23,天然生化物质制备大实验ppt课件,24,取少许Cyt-c稀释后按下表进行含量测定：,空白一,样品一,空白二,样品二,buffer,2.9,1.4,2.9,1.4,Cyt-c,0,1.5,0,1.5,K,3,Fe(CN),6,0.1,0.1,0,0,连二亚硫酸钠,0,0,几粒,几粒,A,550,取少许Cyt-c稀释后按下表进行含量测定：空白一样品一空白二,25,计算,Y(mg)A,550,M,Wt,3,1.5,V(mL),稀释倍数,M,Wt:,Cyt-c,的分子量（12400 Dal）,3:比色时溶液的体积,1.5:,Cyt-c,溶液的体积,V:制备所得的,Cyt-c,溶液的总体积,计算Y(mg)A550 MWt,26,五、注意事项,1.力争除尽猪心非心肌组织，如脂肪、血管、韧带和积血。,2.提取、中和要注意调节pH。吸附、洗脱应严格掌握流速。,3.盐析时，加入固体,(NH,4,),2,SO,4,，要边加边搅拌，不要一次快速加入。,4.逐滴加入三氯乙酸，搅匀，加完后，尽快离心。,5.透析袋要求不漏。,五、注意事项1.力争除尽猪心非心肌组织，如脂肪、血管、韧带和,27,六、结果与讨论,1.从猪心中提取、分离、纯化Cyt-c化合物的原理是什么？,2.凝胶过滤层析常见问题有哪些？,3.如何解决分辩率不高 的问题？,4.一般在粗品制备阶段和精品纯化阶段分别应采用哪些层析分离技术？,六、结果与讨论1.从猪心中提取、分离、纯化Cyt-c化合物,28,人造沸石的再生方法,使用过的沸石先用自来水洗去硫酸铵，再用0.2mol/L0.3mol/L氢氧化钠和1mol/L氯化钠混合液洗涤至沸石成白色，最后用水反复洗至pH78，即可重新使用。,人造沸石的再生方法使用过的沸石先用自来水洗去硫酸铵，再用0.,29,中国药典,（gg）：,表示溶液100 g中含有溶质若干g的符号。,（ml ml）：,表示溶液100 ml中含有溶质若干ml的符号。,（g ml）：,表示溶液100 ml中含有溶质若干g的符号,。,中国药典（gg）：,30,