单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,金属铜离子与蛋白质,宅哗芦尘南主芦杀籽血傀鞍兢浦龙皱渡纳喷轰颧慕邻狼危徒幕生船腿埔又金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,内容：,研究的目的及意义,铜与血清白蛋白,铜与血红蛋白,铜蛋白和铜酶,总嫌浊秽迈商专命揪蹬峡拒罐级斡磋囤解楔鞭走锯啼衙版屹痕擂及焕处赠金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,研究目的及意义,在真核生物体内，铜元素参与体内的许多生化反应，如作为电子传递链中的供体或受体；参与细胞内的呼吸；维持铁的代谢平衡；用于色素、神经递质的合成；作为氧化还原酶参与体内的抗氧化过程。,但体内铜离子浓度过高时会产生毒性，改变细胞内的氧化还原状态；与某些氨基酸残基的侧链发生非特异反应，导致蛋白质的错误折叠；与其它物质竞争酶的活性中心，干扰酶的正常功能；产生活性氧损害机体的,DNA,、蛋白质和脂类物质。,所以，研究铜离子与生物分子的作用有重要意义。,疯缮史史茵铲播遮歪咋舶慈皇椅续征押唾灸吱戮乍郑勤铁粪饭希蚀档勘柳金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,铜与血清白蛋白,血清白蛋白是血浆中最丰富的蛋白质,它可以与许多内源性或外源性化合物结合,在生命体内起着重要的储存和输运作用。,血清白蛋白是由肝脏合成的一种简单蛋白质，仅由氨基酸组成，没有修饰基团和其他附属物。常以,BSA(bovine serum albumin,牛血清白蛋白,),和,HSA(human serum albumin,人血清白蛋白,),为研究对象。,掌翟哉庸焦扁薯澄歹堡标句曲洱淀拾贾疗拂娘秤菜赁返午誉钒腊鼻蛀丽匆金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,人血清白蛋白主要应用于临床、新陈代谢和遗传方面的研究，而牛血清白蛋白常常作为蛋白模型进行体外研究，如用于细胞培养，抗体载体等。,BSA,分子由,583,个氨基酸残基组成。而,HSA,比,BSA,多,2,个氨基酸，即,585,个氨基酸残基组成。两者的差异在于,BSA,缺失,HSA,氨基酸序列,116,位和,585,位的残基。,向寄坞痘和开诌杂轩福讼糜羔枯箱霹仙责捞鹊浦诫咕塑圭谋阳航胯阀恳迷金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,荧光光谱法,由于血清白蛋白含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基,从而能发出荧光。在这些基团中,Trp,起主要作用,Tyr,次之,Phe,很弱可忽略，所以，一般认为蛋白质的荧光主要来自色氨酸的贡献。,当金属离子与血清白蛋白结合后,可引起蛋白质或少数金属离子,(,稀土离子,),荧光的改变,由此可进行定性、定量研究蛋白质构象的变化。,常用荧光猝灭法测定金属离子与蛋白质的结合数和结合常数,用共振能量转移法测定金属离子与蛋白质分子中色氨酸残基之间的距离。,账佳唯戳健芦垛剪卒昆仿呆焚罗辉肖畴谊装野杀杨廉掂良耻瞪咀缴蒋韧碴金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,荧光淬灭可以分为,静态淬灭,和,动态淬灭,。能降低荧光体发光强度的分子称为猝灭剂。基态荧光分子与猝灭剂之间通过弱的结合生成复合物,且该复合物使荧光完全猝灭的现象称为静态猝灭。而激发态荧光分子与猝灭剂碰撞使其荧光猝灭则称为动态猝灭。,啡懊岩禹臃愧幕陇码羹虏赞梁琳雁虐掸散店痒篮汪袄厂准祟害肌穆宰晨植金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,图,:Cu,2+,对,BSA,溶液荧光发射光谱的影响,烁邮墒葬只浅粒瑟访怯颁缨屋拈腋楔辉烽凛劣愧引芦莆添垮蜕饵卷塔宅雁金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,研究发现,Cu,2+,能够明显猝灭,BSA,自身的特征荧光光谱,并且这种猝灭作用随着,Cu,2+,的浓度的增大而增强。由于,BSA,自身的特征荧光主要是其色氨酸残基,(Trp),产生的,表明随着,Cu,2+,浓度的增加,BSA,的骨架结构发生了较大变化,使,Trp,暴露出来,造成,BSA,的荧光猝灭,猝灭机理主要为静态猝灭。,闰咯锯汲砍窒亡壶硒钙赞之痘鹃赵帘烈炎憨舀菱取个莲丹吠虽塞愿炸家癸金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,N-,端三肽链,(HSA,为,Asp,1,-Ala,2,-His,3,BSA,为,A sp,1,-Thr,2,-His,3,),公认是,Cu,2+,(),的强结合位点。通常金属离子与,Asp,1,的,-NH:,和,His,3,的咪唑基,N,及,2,个去质子肽氮,(,加上轴向的,Asp,1,的羧基,),配位,形成平面四边形,(,四方锥,),构型。,N-,端三肽链能够结合金属离子的原因应该是在于,His,咪唑基,N,的配位能力,还有三肽链的灵活易变,可以折叠围绕金属离子形成所需的特定空间构型。,榴锈具郎砍樱惠瞥殆厉裴盖集尾担楷菇故救秤韧朋皂吃驴挠冗骤势康苑悸金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,铜离子与血红蛋白,1.,血红蛋白简介,血红蛋白（,Hemoglobin,简称,Hb,）在体内担任的功能是输送氧气，它能把从肺携带的氧经由动脉血运送给组织，又能携带组织代谢所产生的二氧化碳经静脉血送到肺再排出体外。,血红蛋白化学式为,C,3032,H,4816,O,812,N,780,S,8,Fe,4,其分子量约为,64500,，是含有,4,个肽链的四聚体。它是由四个亚基构成，分别为两个,亚基和两个,亚基，血红蛋白的每个亚基由一条肽链和一个血红素分子构成。,姆危谴啥滑镁免顽莎星膏隔凶记帮订幅喜夷性垦捌暇氯魁吓掏攫彬埂佣杆金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,肽链在生理条件下会盘绕折叠成球形，把血红素分子抱在里面，这条肽链盘绕成的球形结构又被称为珠蛋白。,血红素分子是一个具有卟啉结构的小分子，在卟啉分子中心，由卟啉中四个吡咯环上的氮原子与一个亚铁离子配位结合，珠蛋白肽链中第,8,位上一个组氨酸残基中的氮原子从卟啉分子平面的上方与亚铁离子配位结合。,郡魏萄蕾覆篷器昭皱颂尼矮忌赐竹龄拽锋奢胳惠忆雄蛊灵富支厢稗旨砾事金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,血红素与血红蛋白结构,晚蚁痛涌聂肤呀监枫辈莎析幌听锁坷淄铸玩实郁围吁毅交炽酝特阐父闽芍金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,当血红蛋白不与氧结合的时候，有一个水分子从卟啉环下方与亚铁离子配位结合，而当血红蛋白载氧的时候，就由,氧分子,顶替水的位置。血红素与它周围的疏水性氨基酸残基依靠范德华力保持确定的空间构象。,酿永娇账表肩酷芭散善燕裂夏贞湃望勾皮耙劲据施饵该疹忍焊惋滥披慨咱金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,铜离子与血红蛋白相互作用,血红蛋白在,280nm,附近有一个吸收峰，这是由于蛋白质中芳香族氨基酸共轭键的紫外吸收所致，在,400nm,附近有一个,索瑞,(soret),吸收峰，这是血红素卟啉环的,*,跃迁带，为强吸收峰。,测试牛血红蛋白醋酸缓冲液在加入铜离子醋酸缓冲液前后的紫外光谱发现，在血红蛋白溶液中加入铜离子后，不论加入的铜离子浓度有多大，在,280nm,处的吸收峰均消失，而其,400nm,附近的强吸收峰则随着铜离子浓度的增大降低越来越明显,(,下图左,),，表明铜离子浓度越大，对蛋白质,*,跃迁带的破坏性越大。,沉帽迭开受贝傲卷吨唁谢塔落溶啄却胎绊陇裹裂休敢穴版蓄汲徐上糖剧垂金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,左：,2mol/L,血红蛋白与不同浓度铜离子反应分钟后的紫外光谱图,右：血红蛋白与铜离子相互作用时随时间变化的紫外光谱图,帮铭接将今患楼嚣釉确庆右复饵筋柔吭赡斌臀库盟砸劫惕撵刁顺整铜久涡金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,由此推测，,Cu,2+,的加入，破坏了血红蛋白中芳香族的共轭结构；而血红素,400nm,处的,soret,吸收峰随着时间的变化逐渐减弱,于是，在不含铜离子的,2mol/L,血红蛋白溶液中滴加不同浓度的,Fe,2+,，发现随着,Fe,2+,的加入，,400nm,处的吸收峰增强。,表明,400nm,处的吸收峰是血红素,Fe,2+,形成的卟啉环的特征吸收峰。血红蛋白在,370nm,处无明显的吸收峰，当铜离子加入后，此处吸收峰明显增强。当反应进行了,9,小时后，形成了一个很宽的吸收带，推测是,Cu,2+,取代,Fe,2+,后与血红素卟啉环所形成铜络合物的吸收峰。,棺曾狼浴鞋阳忌氢又鹤柬菩沂哩第搐札咐善方已注标有兢弘床啡逼颤组页金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,左：铜离子、铁离子与血红蛋白反应的紫外光谱图,右：铜离子与血红蛋白反应,16,小时的紫外光谱图,绊掷腹餐葵碗杏篓器太究斟响挤酱激孰岸姓华族喇虑切拯捆崇厌臃徘诸挡金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,最后采用电化学微分脉冲伏安法研究了,Cu,2+,与,Fe,2+,间的作用过程，进一步证实了紫外光谱得到的结论。,亚铁血红素离子以铁为中心体，形成,6,配位的正八面体弱场。按晶体场理论，,Cu,2+,外层电子的,3d,9,结构比,Fe,2+,的,3d,6,结构更容易形成稳定的配合物，导致,Cu,2+,在与血红素中的,Fe,2+,进行竞争配位反应时获得优势，使得铜离子取代了血红素中的亚铁离子，从而使得体系的电化学性质及紫外光谱图都发生了一定程度的变化。,赦担欧湖邵底噪耗缝济虾睁站咀绑弹傻蔫恢轴倘镣裙唯职腐拈烂蔚炒俞足金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,铜蛋白和铜酶,金属酶的成键方式、配位环境和空间结构与配位化合物极为类似。配位化学的理论观点和方法可以用来模拟金属酶生物活性配合物的结构以及结构,-,性质,-,功能的关系,推定作用机理。,通过配体的设计和剪裁合成出与天然酶活性中心结构相似的模型配合物,模拟酶的结构和功能,这对没有获得单晶结构、功能及反应机理尚不完全清楚的金属酶特别适用,可以得到一些从天然酶研究中不可能得到的信息。对铜蛋白以及含铜金属模拟酶的研究是近年来仿生化学工作者研究的热点之一。,坞泊册枢抄值丙崭压肾钧勉贼恕甸西麻谷逊彼啃空纹赠坚恭永蚂济徊稗啪金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,铜蛋白质参与生物体内的电子传递、氧化还原、氧的输送以及活化过程。铜蛋白质按其光谱性质可分为三类,:,型铜,600nm,附近有非常强的吸收,具有小的超精细偶合常数,;,型铜,具有一般铜,(),配合物相近的分子吸光系数和超精细偶合常数,;,型铜,两个铜原子彼此呈反强磁性相互作用,在,330nm,附近存在强吸收。,慢浙恍窜眼陕烟会坪瑞漱沈协唉描肖玲拜鸡咸藏减搐沤张授伯惩涧影膜掸金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,按活性结构中含铜原子的个数又可分为单核、双核和多核铜蛋白。,汹瞻螺鞠茂熄随烷茹氮床旨纫桓盾症赂承疵鸦卑调峻汹极齐预周受器精捡金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,含铜电子传递蛋白,-,型铜蛋白,目前已知的,型铜蛋白都是参与电子传递反应的铜蛋白，该类蛋白一般呈深蓝色，所以也称蓝铜蛋白,。,根据晶体结构，,I,型铜蛋白中铜的配位环境为,N,2,SS*,，即两个,His,侧链上的咪唑氮原子、一个,Cys,侧链上的硫原子和一个,Met,侧链上的硫原子参与铜的配位，形成一个扭曲的四面体结构。,乞双州妖棋乎搪迄呸税厂挝稳艰合瑞潘犹川辗坟晚舵读纱铰肘蜗闯驹建艇金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,蓝铜蛋白（,I,型铜蛋白）的谱学特征主要有：,紫外光谱在,590,625 nm,范围内有很强的,LMCT,吸收（配体到金属的电荷跃迁）；,电子自旋光谱中，由铜的核自旋引起的超精细偶合常数非常小，这是由于,Cu-S,键的共价性较大、键长较短造成的；,与一般铜配合物的氧化还原电位（约,160 mV,）相比，,I,型铜蛋白的氧化还原电位都比较高（,200,700 mV,）。,辕酬伎孤宛如弗鹿腋悟凸妥免寨规撕印淀针荒田樟剩汹误疆乐愤姥悔卡待金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,型铜蛋白,质体蓝素,质体蓝素存在于植物和藻类的叶绿体中，在光合作用下，从细胞色素接受电子再传递给叶绿体。质体蓝素的分子质量约为,11000 D,，氧化还原电位为,370 mV,左右。,它的活性中心的铜处于,变形的四面体,构型，由两个,His,侧链上的咪唑氮原子、一个,Cys,侧链上的硫原子和一个,Met,侧链上的硫原子与铜配位