单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,噬菌体展示技术的原理,噬菌体展示技术的原理,噬菌体展示的基本概念,将外源蛋白质或多肽的基因表达产物与噬菌体衣壳蛋,白融合,并在其表面展示,同时将其遗传密码信息整合到个体,噬菌体的基因组中。直接将可见的表达型与其基因型联系在,一,起,利,用,其,配,体,的,特,异,性,亲,和,力,将,所,感,兴,趣,的,蛋,白,质或多肽挑选出来。,多年来,噬菌体展示技术被用于,抗体的制备,、,多肽及蛋,白质和酶的制备,。特别是近几年来,该技术被作为一种新工,具用于,多肽和蛋白质药物的发现与研制,、,蛋白质与蛋白质的,相互作用,及,蛋白质与,DNA,相互作用的研究,、,蛋白质结构和功,能,的,研,究,以,及,基,因,治,疗,药,物,的,定,向,传,递,等,多,方,面,的研究。,噬菌体展示的基本概念 将,一,、噬菌体展示技术的原理,Lead,Hv,Link,Lv,PIII,PIII,表达型,融合蛋白,P,菌毛蛋白,3,5,个拷贝,P,主要衣壳蛋白,2700,3000,个拷贝,基因型,一、噬菌体展示技术的原理 Lead Hv Link Lv P,噬菌体展示技术是将各种多肽或蛋白质以融合蛋白的形,式表达并展示在噬菌体表面，同时将其遗传密码包含于噬菌,体内部，这使得蛋白质的功能与其基因密码有机的连结在一,起。,选择方法：,淘选（,Panning),而不是,筛选（,Screening),噬菌体展示技术是将各种多肽或蛋白质以融合蛋白的形式表达,Solid phase selection with immunotubes,B,B,B,B,B,B,v,v,Immunotube,coated with,antigen,coated with,steptavidin and,biotinylated antigen,B,Solid phase selection with imm,biotin,antigen,Solution phase selection with biotinylated antigen,biotin antigen Solution phase,Bind to Streptavidin,coated microtitre wells,Bind to Streptavidin coated mi,Wash to remove unbound phage particles.,Wash to remove unbound phage p,Elute bound phage,Elute bound phage,Amplify eluted phage,Repeat selection,Analyze,a)ELISA,b)Specificity,c)Sequencing,d)Affinity,e)Activity,E.coli,感染,和扩增,Amplify eluted phage Repeat s,?,?,固相,?,淘选系统,完整细胞,?,组织，器官,?,常规法,?,淘选方法,正负法,?,竞争法,?,?,噬菌体展示技术最关键的优势有三：,?,第,一,，淘选,的,高,效,率,使,得,在,极低的,存,在,水平下，挑选到高亲和力噬菌体成为可能；,?,第二，所挑选到的噬菌体可在微量存在的,情况下，通过感染细菌得到富集；,?,第三：展示的多肽或蛋白质与其包含在噬,菌体内部的基因密码的连接，使得结合肽,或蛋白质的序列分析既快速又简便。,?噬菌体展示技术最关键的优势有三：?第一，淘选的高效率使,?,?,噬菌体（,M13,T7,T4,?,),?,病毒（反转录病毒，杆状病毒）,?,表面展示系统,细菌（葡萄球菌，,E.Coli),?,酵母,?,体外共价连接（蛋白,DNA,?,蛋白,RNA),?,?,诊断,?,被动免疫,?,抗体,蛋白质结构分析,?,药物导航,?,蛋白质纯化,应用范围：,?,?,受体,配体,?,信息传递,?,蛋白质,蛋白质,诘抗剂,?,蛋白质,DNA,抑制剂,?,蛋白质,其他,?,多肽,诊断,?,基因表达控制,?,中和活力,?,药物及药物导航,?,酶及底物,?,噬菌体抗体库的构建,噬菌体抗体库的构建,Antibody IgG structure,Antibody IgG structure,Antibody IgG structure,Antibody IgG structure,V,H,V,L,C,L,C,H1,C,H2,C,H3,Hinge,(Fab),2,Fab,Fc,Membrane,Extension,Antibody IgG structure,V H V L C L C H1 C H2 C H3 Hin,V,H,V,L,C,L,C,H1,C,H2,C,H3,Antibody IgG structure,V H V L C L C H1 C H2 C H3 Ant,V,H,V,L,C,L,C,H1,C,H2,C,H3,Fv,V H V L C L C H1 C H2 C H3 Fv,Fv,V,H,V,L,scFv,V,H,V,L,Single Chain Fragment variable,Fv V H V L scFv V H V L Single,噬菌体展示技术的原理课件,噬菌体展示,ScFv,抗体操作示例,PCR,产物的酶切（先平连再消化）,载体的酶切,库的连接反应,电穿孔转化,感受态,E.Coli TG1,细胞的制备,抗体库的构建,筛选,检测,分泌型,ScFv,的产生,测序,包括数轮,识别,-,洗脱,-,复制,的过程,?,活性克隆制备,质粒,DNA,，,V,H,和,V,L,基因重新,克隆于通用载,体，利用通用,引物测序。,?,PCR,直接测序,?,电穿孔导入,?,加入,AMP,抗性,?,先构建轻链，,再构建重链,?,加入辅助噬菌体,?,加入卡那霉素,?,PEG-NaCl,收集,a)ELISA,检测,b),特异型检测,c),序列测定,d),亲和性测定,e),活性测定,噬菌体展示ScFv抗体操作示例 PCR产物的酶切（先平连再消,噬菌体展示技术的原理课件,单克隆抗体,噬菌体抗体,杂交瘤技术,展示技术,宿主细胞,:,杂交瘤,细菌,筛选范围,:10,3,10,7,?,10,9,时间,:,几个月,几周,操作,:,繁杂,相对简单,免疫,:,必须,可避免,人源抗体,:,?,+,费用,:,高,低,生产量,:,有限,无限,基因获取,:,再克隆,直接,应用前景,:,有限,不可估,单克隆抗体,二、噬菌体展示技术的应用现状,1.,抗体：,抗狂犬病毒的单链抗体，,抗,HIV-1,囊膜糖蛋白的单链抗体，此,抗体可专一性杀死被,HIV-1,感染并,表达有,gp120,的淋巴细胞,中和响,尾蛇毒素的单链抗，,等等,。,二、噬菌体展示技术的应用现状 1.抗体：,2.,疫苗：,展示在噬菌体表面的,HIV-1,的,gp120-V3,环,可象天然抗原一样引起,显著的免疫应答,等等。,2.疫苗：展示在噬菌体表面的HIV,3.,多肽类药物：,如一些激动剂或拮抗剂从多肽库中分,离鉴定出来；已获得一,13,肽，它能中和,蛇毒,-bungarotoxin,；从,CX,7,C,多肽库中,掏选到一个多肽能与,Hantavirus,结合，,并使该病毒不能结合或感染细胞。人血管,促生素（,angiogenin,）是一种能促进肿瘤,血管生长的蛋白，用这个蛋白去淘选一个,噬菌体展示多肽库，所获得的一个环状,8,肽能与血管促生素结合，并能阻遏血管促,生素的活性；等等。,3.多肽类药物：如一些激动剂或拮抗剂从多,4.,肿瘤药物导航载体：,用肿瘤细胞特殊的受体蛋白从展示文库,中淘选到的多肽或单链抗体，可以作为,抗癌药物的定向输送工具,。一个成功的,实例是：将噬菌体多肽展示库注射入具,有肿瘤的小鼠体内，然后杀死小鼠，取,出肿瘤，再将结合其上的噬菌体洗脱下,来。展示在其上的多肽具有与该肿瘤的,特异性亲和力。将此多肽与细胞毒素,doxorubicin,偶联。结果显示，此偶联物,具有更强的抑制肿瘤的效果,.,4.肿瘤药物导航载体：用肿瘤细胞特殊的受体蛋白从展,5.,酶：,例：碱性磷酸酶，蛋白水解酶类，,等等,6.,底物与抑制剂：,主要是蛋白酶的底物和其抑制剂。,5.酶：例：碱性磷酸酶，蛋白水解酶类，等等,7.,信息传递研究,:,利用噬菌体展示多肽库，发现了一些受体，,如凝血致活酶、黑皮质素受体、,CD80,和一,个,Hantaviral,受体；受体的配体，,如血管促,生素、,-bungarotoxin,，,和一些大蛋白分子,中的折叠区域，如,SH2,、,SH3,和,WW,区域。,从多肽库中可分离到与天然激素相似的、与,受体结合的高亲和力的多肽,因此用完整细,胞可以从多肽库中找到受体的高选择性配体。,在不知道任何有关的受体和配体信息的情况,下，用完整细胞和组织或动物，可筛选到特,异与靶组织结合的多肽和蛋白。,7.信息传递研究:利用噬菌体展示多肽库，发现了一,8.DNA,结合蛋白,：,锌指蛋白是一类,DNA,结合小肽结构物，,这些结构含有锌，能用于构建一个大的蛋白,区域，去识别和结合特殊的,DNA,序列。噬菌,体展示技术也可以用于创造一个大的、具有,识别不同,DNA,序列的,锌指的多肽库。利用,这个多肽库，可以研究有关氨基酸序列与,DNA,结合位点之间的识别规则，可以通过设,计,锌指多肽去控制基因的表达，比如抑制小,鼠细胞系中的癌基因，也可以启动表达质粒,的基因，或干扰病毒感染生活周期。,8.DNA结合蛋白：锌指蛋白是,9.,蛋白质组学,：,噬菌体展示技术作为一个多肽和蛋白质,合成的工具箱，使得任何蛋白均能找到与其,有特异结合力的多肽和蛋白质，其构建的文,库的滴度可达,10,12,。蛋白质组学的基本点就是,利用蛋白质,-,蛋白质的相互作用，对成千上万,种蛋白质同时进行分析。而噬菌体展示技术,正好能符合这种要求。例：将噬菌体展示,cDNA,文库制成蛋白点阵，成功的应用于寻找,与过敏症有关的蛋白质。,9.蛋白质组学：噬菌体展示技术作为一个,