单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,杂交瘤技术制备单克隆抗体,杂交瘤技术制备单克隆抗体,第1页,单克隆抗体（,McAb,）：,是由只识别单一抗原决定簇,B,细胞克隆产生同源抗体。,理化性状高度均一,效价高,只与一个抗原表位发生反应、生物活性单一,含有高度特异性又易于大量制备,杂交瘤技术制备单克隆抗体,第2页,怎样取得,McAb?,怎样大量取得,McAb?,需要克服哪些技术问题？,杂交瘤技术制备单克隆抗体,第3页,理想抗体分泌细胞：,含有合成和分泌抗体能力,含有大量无限生长特征,杂交瘤技术制备单克隆抗体,第4页,在,1975,年，,Kohler,和,Milstein,未起源于小鼠骨髓,骨髓瘤细胞,和啮齿动物能够,分泌抗体细胞,融合后形成杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞含有肿瘤细胞无限繁殖能力，也含有免疫细胞分泌抗体能力，以后将这种杂交细胞系统统称为,杂交瘤,（,hybridoma,）。,经过筛选，分离得到针对,特异性抗原,并含有所要求抗体亲和力,杂交瘤细胞,。在适当营养条件下，杂交瘤细胞能够,生长和无限制性传代,，而且能产生,大量单一类型抗体,及单克隆抗体。,杂交瘤技术制备单克隆抗体,第5页,一、杂交瘤技术基础原理,二、单克隆抗体制备,三、单克隆抗体应用,杂交瘤技术制备单克隆抗体,第6页,一 杂交瘤技术基础原理,利用,聚乙二醇,作为细胞融合剂，使免疫,小鼠脾细,胞,与含有在体外不停繁殖能力,小鼠骨髓瘤细胞,融为一,体，在,HAT,选择性培养基,作用下，只让融合成功杂交瘤细胞生长，经过重复免疫学检测筛选和单个细胞培养（克隆化）,最终取得既能产生所需单克隆抗体,又能不停繁殖,杂交瘤,细胞系,，将这种细胞扩充培养，接种于小鼠腹腔，在其产生腹水中即可得到高效价,单克隆抗体,。,杂交瘤技术制备单克隆抗体,第7页,流,程,杂交瘤技术,杂交瘤技术制备单克隆抗体,第8页,1.,颗粒性抗原,免疫性较强，不加佐剂就可取得很好免疫效果,2.,可溶性抗原,免疫原性弱，普通要加佐剂，,可溶性抗原10-,50ug/100ul+,等量弗氏完全佐剂注射小鼠腹腔，,2-4周后加强免疫（量减半，改用不完全佐剂，可重复屡次）,冲击免疫（融合前3天进行）,选取6-12周龄,Balb/c,小鼠,免疫方案,杂交瘤技术制备单克隆抗体,第9页,不产生,Ig,重链和轻链,HGPRT-,与提供淋巴细胞动物品系相同,小鼠骨髓瘤细胞,杂交瘤技术制备单克隆抗体,第10页,处于免疫状态脾脏中,B,淋巴母细胞或浆母细胞,动 物：,6,12,周龄,20g,25g,体重,免疫脾细胞,杂交瘤技术制备单克隆抗体,第11页,细胞融合剂：,PEG:,分子量,4000,PEG,是最常见细胞融合剂,作用机理：,诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有利于细胞融合,作用特点：,不一样分子质量、浓度、作用时间、,pH,可能直接影响融合效果,细胞融合,杂交瘤技术制备单克隆抗体,第12页,培养骨髓瘤细胞：,对数生长久,浑圆、透亮、均一、排列整齐,防止细胞返祖：定时用,8-AG,处理细胞,1-210,7,免疫脾细胞制备：,1-2,10,8,无菌手术,杂交瘤技术制备单克隆抗体,第13页,喂养细胞：,常见小鼠腹腔巨噬细胞，,5-810,6,分泌细胞生长因子,吞噬衰老细胞和微生物,存活普通不超,2,周，不影响杂交瘤细胞纯化,杂交瘤技术制备单克隆抗体,第14页,杂交瘤细胞选择性培养,细胞,DNA,合成途经：,1.替换路径：次黄嘌呤（,H）,HGPRT,2.主要路径：,氨基酸 鸟嘌呤核苷酸,谷氨酰胺 （,A-）,尿核苷单磷酸 胸腺嘧啶核苷酸,TK,3.次要路径：胸腺嘧啶核苷（,T）,杂交瘤技术制备单克隆抗体,第15页,HAT,培养基：,H,（,Hypoxanthine,）,:,次黄嘌呤,A,（,Aminopterin,）：,氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断,DNA,合成主要路径,T(Thymidine),：,胸,腺嘧啶核苷；,“,核苷酸前体,”,，供细胞经过替换路径合成,DNA,HAT,选择培养基原理,杂交瘤技术制备单克隆抗体,第16页,HAT,选择作用：,淋巴细胞：,不能生长，,5,7,天死亡；,DNA,合成主要路径被,A,阻断,骨髓瘤细胞：,不能生长，,5,7,天死亡；,HGPRT,缺乏，,DNA,合成替换路径受阻,杂交瘤技术制备单克隆抗体,第17页,杂交瘤技术制备单克隆抗体,第18页,克隆化：,指将抗体阳性孔进行克隆化。目标是将抗体分泌,细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。,克隆化标准：,尽早进行，重复4-5次,阳性杂交瘤细胞克隆化,杂交瘤技术制备单克隆抗体,第19页,有限稀释法,(limiting dilution),软琼脂平板法,(soft agar method),单细胞显微操作法,(micromanipulation),荧光激活细胞分类法法（,fluorescence activated cell sorter,，,FACS,）,克隆化方案：,杂交瘤技术制备单克隆抗体,第20页,特点：,不需任何特殊设备,克隆出现效率高,试验室常见方法,方法：,细胞悬液经过系列稀释,每个培养孔含,0.5,1,个细胞,有限稀释法,杂交瘤技术制备单克隆抗体,第21页,在没有建立一个稳定分泌抗体细胞系时，细胞培养过程中随时可能发生细胞污染，分泌抗体能力丧失等,“,慢冻,”,：,分步冷冻，,30-70,液氮,“,快融,”,：,取出马上浸入,37,40,水浴中，使其快速融化、复苏,杂交瘤细胞冻存与复苏,杂交瘤技术制备单克隆抗体,第22页,预防污染,防止染色体丢失,预防非分泌细胞过分生长,预防细胞密度过高而死亡,细胞冷冻意义,杂交瘤技术制备单克隆抗体,第23页,杂交瘤细胞检定,1.,抗体分泌稳定性,抗体连续传代法,-,保持稳定分泌特异性抗体,2.,细胞核学特征,检验细胞分裂中期染色体,-,确保不丢失产生抗体基因染色体,3.,鼠源病毒检验,细胞试验，动物抗体产生试验，鸡胚感染试验等,-,排除单抗制品病毒污染,4.,支原体检验,荧光染色法，培养法，分子生物学法等,预防污染,5.,无菌试验,直接接种法，薄膜过滤法,杂交瘤技术制备单克隆抗体,第24页,二 单克隆抗体制备,经过重复克隆化取得,抗体阳性杂交瘤细胞株,应马上扩充培养（除及时冻存细胞外）。因屡次传代易引发,染色体逐步丢失,而使细胞,产生抗体能力,逐步减弱甚至消失，还应尽早使用取得抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。,杂交瘤技术制备单克隆抗体,第25页,动物体内诱生方法：,操作简便，经济,主要用于生产科研或诊疗用单抗,腹水浓度可达,2-5mg/ml,实体瘤法、腹水制备法,体外培养法：,使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞,工艺简单、易控制，可大规模生产,浓度不高，,200-500ug/ml,悬浮培养法、固相培养法,单克隆抗体产生,杂交瘤技术制备单克隆抗体,第26页,腹水制备法,杂交瘤技术制备单克隆抗体,第27页,预先腹腔注射降直烷或液状石蜡,1-2,周后注射（,1,5,）,10,6,细胞,1,3,w,形成腹水,5-20mg/ml,1-10ml,高滴度腹水,杂交瘤技术制备单克隆抗体,第28页,抗体特异性判定：,抗原类似物交叉反应,Ig,类型、亚类判定：,双扩法或,ELISA,法,McAb,中和活性判定：,动物或细胞保护试验,McAb,识别抗原表位测定：,用竞,争结正当，测相加指数法,McAb,亲和力测定：,ELISA,单克隆抗体性质判定,杂交瘤技术制备单克隆抗体,第29页,注意事项,1.,污染,细菌，真菌，支原体,2.,杂交瘤细胞不分泌或停顿分泌抗体,HAT,中,A,失效；,免疫原抗原性弱，免疫效果差；,支原体污染；,抗体非分泌细胞竞争性生长；,染色体丢失,杂交瘤技术制备单克隆抗体,第30页,预防办法,1.,大量保持和补充液氮冻存细胞原管；,2.,倒置显微镜经常检验细胞生长情况；,3.,不让细胞“过分生长”,4.,不让培养物不加检验任其连续培养几周或几月；,杂交瘤技术制备单克隆抗体,第31页,抗体纯化：,硫酸铵沉淀,凝胶过滤法,离子交换层析,亲和层析,杂交瘤技术制备单克隆抗体,第32页,硫酸铵沉淀,大量盐加入到蛋白溶液中，高浓度盐离子有很强水化力，可夺取蛋白质水化层，使蛋白质胶粒失水发生凝聚而沉淀析出,血清,50%饱和度硫酸胺,上清（清蛋白）沉淀（球蛋白）,33%饱和度硫酸胺,上清 沉淀,拟球蛋白,r,球蛋白,杂交瘤技术制备单克隆抗体,第33页,凝胶过滤法,干燥凝胶颗粒吸水后形成了多孔胶粒，将蛋白质溶液加在凝胶柱上进行洗脱时，大分子蛋白不能穿过凝胶网孔进入胶粒内，留在胶粒间隙溶液中，随洗脱液最先流出，小分子蛋白可穿过凝胶网孔进入胶粒内，受到凝胶阻留，向下移动较慢洗脱出来较慢，据此将不一样大小蛋白质分离出来。,交联葡聚糖凝胶(,Sephadex),琼脂糖凝胶(,Sepharose),杂交瘤技术制备单克隆抗体,第34页,离子交换层析法,DEAE,纤维素：结合溶液中带负电荷蛋白质，又称阴离子交换剂,CM,纤维素：结合溶液中带正电荷蛋白质，又称阳离子交换剂,杂交瘤技术制备单克隆抗体,第35页,亲和层析法,将抗原（或抗体）连接到固相载体上，特异性吸附液相中抗体（或抗原），形成抗原抗体复合物，然后改变条件，使抗原抗体复合物解离洗脱出纯化抗体（或抗原）。,A,蛋白-,Sepharose CL 4B,杂交瘤技术制备单克隆抗体,第36页,三、单克隆抗体应用,检验医学诊疗试剂,（1）病原微生物抗原抗体检测,（2）肿瘤抗原检测,（3）免疫细胞及其亚群检测,（4）激素测定,（5）细胞因子测定,蛋白质提纯,肿瘤导向治疗和放射免疫显像技术,杂交瘤技术制备单克隆抗体,第37页,