,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二十二章 免疫学检测技术的基本原理,p229,第二十二章 免疫学检测技术的基本原理p229,一,.,体外抗原抗体反应的特征,1.,高度特异性,抗原的表位与抗体的抗原结合点结构互补。,2.,可见性,抗原与相应抗体结合后能,肉眼直接观察。,二,.,抗原抗体反应的影响因素,1.,温 度：最适温度为,37,。,2.,酸碱度：最适,p,H=6-8,。,3.,电解质：可促进抗原与抗体的结合。,常用生理盐水。,一.体外抗原抗体反应的特征,抗原抗体比例对反应现象的影响,抗原抗体比例对反应现象的影响,三,.,检测抗原和抗体的体外试验,（一）凝集反应,颗粒性抗原,（,RBC,、细菌等）与相应抗体,结合形成肉眼可见凝集物的现象或反应。,1,直接凝集试验,（,1,）玻片凝集试验：用于,定性测抗原,。,如,ABO,血型鉴定，细菌的鉴定、分型等。,（,2,）试管凝集试验：用于,定量测抗体,如肥达氏反应。,2,间接凝集试验,如类风湿因子的测定等。,三.检测抗原和抗体的体外试验,免疫学检测技术的基本原理-课件,（,二）,沉淀反应,可溶性抗原,（血清蛋白、组织浸液等）与,相应抗体结合而形成可见沉淀物的反应。,因该类反应多在半固体琼脂凝胶中进行，故,又称为,琼脂扩散试验或免疫扩散,。,（二）沉淀反应,1,单向免疫扩散 用于,定量测抗原,。,如检测血清免疫球蛋白、,C3,等含量。,1单向免疫扩散 用于定量测抗原。,2,双向免疫扩散,主要用于,定性检测抗原或抗体,，,抗原组成及两 种抗原相关性分析。,2双向免疫扩散,3,免疫电泳,其方法是,先电泳、后扩散。主要用于,抗原成分的分析,，亦可用于诊断如骨髓瘤、性联低丙种球蛋白血症等的诊断。,3免疫电泳,4,免疫比浊,用于,定量测抗原,。该法快速、简便。,5,）免疫比浊法,在一,定量,的抗体中分别加入,递增量,的抗原，经一定时间后形成免疫复合物。用,浊度计,测量反应液体的浊度，,复合物形成越多，浊度越高,，绘制标准曲线并根据反应液体的浊度，推算样品中的抗原含量。,4免疫比浊5）免疫比浊法 在一定,（三）免疫标记技术,用荧光素、同位素或酶等示踪物质 标记抗体,（或抗原）进行抗原,-,抗体反应。,标记物质与抗体（或抗原）的化学连接未改变,抗体（或抗原）的免疫学特性，且极大的提高了,反应的灵敏度，可以对微量物质进行定量、定性,或定位检测。,免疫标记技术主要有三种基本类型：,免疫荧光技术,免疫酶技术,同位素标记,技术,（三）免疫标记技术,1,免疫荧光技术,(,Immunofluorescence Technique),用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待测标本的抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原抗体复合物散发出荧光，借此对标本中的抗原作鉴定和定位。,（,1,）常用荧光素,异硫氰酸荧光素（,FITC,），显黄绿色。,藻红蛋白（,PE,），显红色。,（,2,）方法,*,直接荧光法：,优点,-,特异性强,缺点,-,每检测一种抗原必须制备相应的荧光抗体。,*,间接荧光法,优点,-,敏感性比直接法高，且制备一种荧光素标记的二抗可,用于多种抗原的检测，,缺点,-,非特异性荧光增加。,1免疫荧光技术(Immunofluorescence Te,免疫学检测技术的基本原理-课件,免疫学检测技术的基本原理-课件,2,酶免疫测定（,Enzyme Immunoassay,EIA,）,用酶标记的抗体进行的抗原抗体反应。,EIA,将抗原抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后显色来判定结果。,其检测的敏感度可达,pg-ng/ml,水平。,Ab +E Ab,E,Ag +Ab,E,AgAb,E,+,底物,呈色反应,2酶免疫测定（Enzyme Immunoassay,E,EIA,EIA,（,1,）,标记的酶,：,辣根过氧化物酶（,HRP,）、碱性磷酸酶（,AP,）。,（,2,）常用方法,:,A,酶联免疫吸附试验,(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA),将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。用洗涤法将液相中游离成分洗除,.,用于可溶性抗原和抗体的检测。,（1）标记的酶：,*,间接法：用于检测抗体,*间接法：用于检测抗体,*,双抗体夹心法：用于检测抗原。,*双抗体夹心法：用于检测抗原。,B,免疫组化技术,检测组织中或细胞表面的抗原。,对抗原进行定性、定量、定位检测。,C,酶联免疫斑点试验（,ELISPOT,）,可用于细胞因子的检测,B 免疫组化技术检测组织中或细胞表面的抗原。,3,放射免疫测定法（,RIA,）,敏感度可达,pg,水平，其标记物为,125,I,、,131,I,等。,常用于,微量物质的检测,，如激素、,IgE,等。,3放射免疫测定法（RIA）,4,化学发光免疫分析,该法是将发光物吖啶酯、或鲁米诺标记抗原或抗体进行的结合反应。,发光物质在反应剂激发下生成激发态中间体，当激发态中间体回到稳定的基态时发射出,光子,，用自动,发光分析仪,能接收光信号，测定光子的产量，以反映待检样品中抗体或抗原的含量,。,其灵敏度高于,RIA,，常用于,超微量物质的测定,，,如甲状腺素等。,4化学发光免疫分析,5,免疫印迹法（,Western blotting,）,该法是将凝胶电泳与固相免疫相接合的检测技术，即将电泳分区的蛋白质转移到固相载体，再用酶免疫、放射免疫技术测定。,常用于检测多种病毒的抗原或抗体。如检测,HIV,抗体。,5免疫印迹法（Western blotting）,免 疫 印 迹 法 示 意 图,免 疫 印 迹 法 示 意 图,免疫学检测技术的基本原理-课件,HIV,的免疫印记,HIV的免疫印记,免疫胶体金技术,免疫胶体金技术,