,第,3,课时,微生物数量的测定,第,1,章微生物技术,第3课时微生物数量的测定第1章微生物技术,学习导航,1.阅读教材P,17,内容，概述测定某种微生物数量的方法和步骤。,2.结合教材P,1517,“,测定土壤中微生物的数量,”,实验，掌握使用平板菌落计数法测定土壤中微生物的数量。,重难点击,1.掌握测定某种微生物数量的方法和步骤。,2.学会使用平板菌落计数法测定土壤中微生物的数量。,学习导航,一、微生物数量测定的方法和原理,二、土壤中尿素分解菌数量的测定,内容索引,当堂检测,一、微生物数量测定的方法和原理二、土壤中尿素分解菌数量的测定,一、微生物数量测定的方法和原理,一、微生物数量测定的方法和原理,基础梳理,微生物数量的测定也是重要的微生物技术之一，平板菌落计数法是一种应用广泛的微生物数量测定方法。,1.,平板菌落计数法的原理：根据微生物在高度稀释的条件下，,培养基上所形成的单个菌落，是由,繁殖而成的，即一个菌落代表,。,2.,计算方法：从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算方法是：同一稀释度的菌落平均数,0.2,稀释度,10,。,固体,一个单细胞,一个单细胞,基础梳理微生物数量的测定也是重要的微生物技术之一，平板菌落计,3.优缺点,(1)优点：能测出样品的,数，可用于微生物的选种与,、分离纯化及其他方面的测定。,(2)缺点：操作烦琐、时间较长、测定值常受各种因素的影响。,4.该方法统计的菌落数比活菌的实际数目低，这是因为,_,。,活菌,育种,当两个或多个,细胞在一起时，平板上观察到的只是一个菌落,3.优缺点活菌育种当两个或多个细胞在一起时，平板上观察到的只,1.为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？,答案,土壤中各种微生物的数量是不同的，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离。,问题探究,答案,1.为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？问题探究答案,答案,2.平板菌落计数法,(1)平板菌落计数法根据操作步骤的不同可分为哪两种？,答案,涂布平板法：用灭过菌的涂布器将一定量(一般为0.1 mL)的适当稀释过的菌液涂布在琼脂培养基的表面，然后保温培养直到菌落的出现。记录菌落的数目并换算成每毫升样品中的活细胞的数量。,倒平板法：将已知体积(0.11 mL)的适当稀释过的菌液加到灭过菌的培养皿内，然后倒入溶化后冷却至45,的琼脂培养基，水平晃动混匀，待凝固后保温培养到出现菌落，然后与涂布平板法同样计数。,答案2.平板菌落计数法,(2),平板菌落计数法中换算样品的含菌数依据什么数据换算？,答案,依据稀释倍数、取样接种量和菌落数。,(3),每隔多少小时统计一次菌落数目？应选取菌落数目何时,(,稳定时或不稳定时,),的记录作为结果？,答案,每隔,24,小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。,(4),统计菌落时，要求细菌和放线菌每皿的菌落数目范围是多少？霉菌每皿的菌落数目范围是多少？,答案,若测定细菌和放线菌，要求每皿以,30,300,个菌落为宜，若是霉菌则以每皿,10,100,个菌落为宜。,答案,(2)平板菌落计数法中换算样品的含菌数依据什么数据换算？答案,归纳总结,要使平板菌落计数法准确，需要掌握的关键步骤有：严格的无菌操作，否则容易被杂菌污染；稀释液要充分混匀，吸量准确，否则结果不准确；多做几个重复实验，减少误差。,归纳总结要使平板菌落计数法准确，需要掌握的关键步骤有：严格的,拓展应用,1.用平板菌落计数法来统计样品中活菌的数目。在某稀释浓度下某同学做了若干个平板并统计每个平板的菌落数，最接近样品中菌体数真实值的是,A.菌落数量最多的平板,B.菌落数量最少的平板,C.菌落数量适中的平板,D.取若干个平板菌落数量的平均值,答案,解析,拓展应用1.用平板菌落计数法来统计样品中活菌的数目。在某稀释,解析,用平板菌落计数法对样品中活菌数目进行统计，只是一种估测，根据此方法的实验过程可知，在某一稀释度下涂布的平板菌体数具有一定的偶然性，并不是绝对均匀，所以取若干个平板菌落数量的平均值比较接近样品中菌体数的真实值。,解析用平板菌落计数法对样品中活菌数目进行统计，只是一种估测,2.,若某一稀释度下，平板上生长的平均菌落数为,80,，涂布平板时所用的稀释液体积为,0.1 mL,，稀释液的稀释倍数为,10,6,，则每克样品中的活菌数约为,A.8,10,8,B.8,10,7,C.8,10,5,D.8,10,6,解析,每克样品中的活菌数,(800.1),10,6,。,答案,解析,2.若某一稀释度下，平板上生长的平均菌落数为80，涂布平板时,二、土壤中尿素分解菌数量的测定,二、土壤中尿素分解菌数量的测定,基础梳理,土壤中含有种类繁多的微生物，不同微生物的数量有差别，我们通过实验来测定土壤中尿素分解菌的数量。,1.下面是土壤中尿素分解菌培养使用的培养基的配方，请分析：,成分,用量,尿素,20 g,酵母粉,0.1 g,磷酸二氢钾,9.1 g,磷酸氢二钠,9.5 g,基础梳理土壤中含有种类繁多的微生物，不同微生物的数量有差别，,酚红,0.01 g,琼脂,20 g,加热溶解后，用,1 mol/L NaOH,溶液调,pH,至,7.2,7.4,，补加蒸馏水定容至,1 000 mL,(1),在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是,，提供氮源的是,，琼脂的作用是,。,(2),微生物要利用尿素需要分泌脲酶，不能分泌脲酶的微生物不能利用尿素。因此该培养基对微生物具有选择作用，其选择机制是,_,。,酵母粉,尿素,凝固剂,只有能够分泌脲酶从,而以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长,酚红0.01 g琼脂20 g加热溶解后，用1 mol/L N,(3),细菌合成的脲酶分解尿素产生了氨，使培养基的碱性增强，,pH,上升，使酚红变色，菌落周围变,。可用来鉴定选出的菌落是不是尿素分解菌。,红,(3)细菌合成的脲酶分解尿素产生了氨，使培养基的碱性增强，p,2.结合下图分析实验过程和注意事项,2.结合下图分析实验过程和注意事项,步骤,实验操作,操作提示,制备培养基,分别配制牛肉膏蛋白胨培养基和以,_,为唯一氮源的,培养基,牛肉膏蛋白胨培养基可以作为,，用来判断选择培养基是否起到了,_,制备土壤样品稀释液,称取土样,g,，放入盛有,mL,无菌水并带有玻璃珠的锥形瓶中，充分摇匀；,吸取上清液,mL,，转移至盛有,mL,的生理盐水的无菌大试管中，按照上图流程进行样品的稀释，依次制成稀释度为,10,1,、,10,2,、,10,3,、,10,4,、,10,5,、,10,6,的稀释液,应在,旁称取土样；,要充分摇匀,尿素,选择,对照,选择作用,10,90,1,9,火焰,步骤实验操作操作提示制备培养基分别配制牛肉膏蛋白胨培养基和以,加样,取,10,套无菌培养皿，取,、,_,和,不同稀释度分别做,3,个重复,平板,，留下一个平板做空白对照。,每,皿接种稀释菌液各,0.2 mL,实验时要对所用的平板、试管作好,。如培养皿要注明培养基类型、培养时间、,、培养物等,倒平板,将菌液移入培养皿后立即倒入溶化并冷却至,左右的尿素培养基,(,倒入量为,15 mL),，平置，待凝,倒平板时要晃动培养皿，使,_,混合均匀,培养,将涂布好的培养皿放在,温度下,培养,在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显,选择培养基上的数目，才说明选择培养基有选择作用,10,4,10,5,10,6,标记,稀释度,45,菌液和,培养基,37,多于,加样取10套无菌培养皿，取 、_和,计数,当菌落数目,时，选取菌落数在,_,的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对,个平板进行重复计数，然后求出,，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目,如果学生选取的是同一种土样，结果相差太远，教师需要引导学生一起分析产生差异的原因,稳定,30,300,3,平均值,计数当菌落数目 时，选取菌落数在_,1.,试写出测定土壤中尿素分解菌数量的实验流程。,答案,制备尿素固体培养基,制备土壤样品稀释液,加样,倒平板,培养,统计菌落数,计算样品中的菌数。,2.,甲、乙两位同学用平板菌落计数法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为,10,6,的培养基中，得到以下两种统计结果,(1),甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为,230,，该同学的统计结果是否真实可靠？为什么？,答案,不真实。为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下涂布,3,个平板，统计结果后计算平均值。,问题探究,答案,1.试写出测定土壤中尿素分解菌数量的实验流程。问题探究答案,(2)乙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。该同学对实验结果的处理是否合理？为什么？,答案,不合理。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果不一致的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出差异的原因，而不能简单地舍弃后进行计数。,答案,(2)乙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21,(3),某同学在三种稀释度下吸取,0.1 mL,的菌液涂布平板，统计菌落数，得到以下的数据，试计算,1 g,样品的活菌数。,平板,稀释度,平板,1,平板,2,平板,3,10,3,320,360,356,10,4,212,234,287,10,5,21,23,18,答案,10,4,的稀释度下取,0.1 mL,涂布的三个平板上的菌落数在,30,300,之间，计算其平均值为,(212,234,287)/3,244,。进一步可以换算出,1 g,样品中活菌数为,2440.110,4,10,2.44,10,8,。,答案,(3)某同学在三种稀释度下吸取0.1 mL的菌液涂布平板，统,答案,(4),为什么统计的菌落数比活菌的实际数目低？,答案,当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。,答案(4)为什么统计的菌落数比活菌的实际数目低？,答案,3.微生物数量测定的实验设计,(1)如果平板上长出的菌落不是均匀分散的，而是集中在一起，可能的原因有哪些？,答案,菌体密度太大；倒平板后没有立即摇匀；平板冷凝水太多。,(2)同一个稀释度的3个平板上的细菌的数目应该比较接近，如果长出的菌落数差别较大，可能的原因有哪些？,答案,取样不准确；稀释不均匀；倒平板操作时培养基温度差别较大等。,(3)实验中的无菌操作主要有哪些？,答案,培养基、锥形瓶、试管、铲子、信封等，需要进行灭菌。,称取土壤要在火焰旁进行。,稀释土壤溶液的每一步操作都要在火焰旁进行。,答案3.微生物数量测定的实验设计,归纳总结,分离尿素分解菌操作中的注意事项,(,1,),在实验操作中，每个步骤都要注意无菌操作，以防培养基被污染，影响实验效果。,(,2,),样品稀释液的最佳浓度为获得每个平板上有,30,300,个菌落，这个稀释度细菌一般为,10,4,、,10,5,、,10,6,倍稀释液，放线菌一般为,10,3,、,10,4,、,10,5,倍稀释液，真菌一般为,10,2,、,10,3,、,10,4,倍稀释液。,(,3,),为排除非测试因素,(,培养基,),的干扰，实验需设置牛肉膏蛋白胨培养基进行空白对照。,(,4,),每一稀释倍数的菌液都至少要涂布,3,个平板，作为重复实验，求其平均值，若其中有菌落数与其他平板悬殊过大的，需要对该平板重新制作。,归纳总结分离尿素分解菌操作中的注意事项,拓展应用,3.如图为,“,土壤中分解尿素的细菌的分离和计数,”,实验中样品稀释示意图。据图分析下列叙述正确的是,拓展应用3.如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中,答案,A.4,号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数一定恰为,5,号的,10,倍,B.5,号试管的结果表明每克该土壤中的菌株数目为,1.7,10,8,个,C.,在用移液管吸取菌液进行梯度稀释时，可用手指轻压移液管上的橡皮头，,吹吸三次，使菌液与无菌水充分混匀,D.,某一稀释度下至少涂布,3,个平板，该实验方法统计得到的结果常会比实,际活菌数目高,答案A.4号试管中稀释液