单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二章 天然生物材料的提取制药,生化药物概述,氨基酸类药物的生产,多肽和蛋白质类药物的生产,核酸类药物的生产,酶类药物的生产,糖类药物的生产,脂类药物的生产,维生素和辅酶类药物的生产,核酸类药物的生产,核酸知识复习,核酸药物的分类,核酸类药物的生产方法,核酸类药物的生产实例,核酸类药物的检测,思考题,核酸知识复习,核糖（核糖脱氧核糖）,核苷 嘌呤（腺嘌呤、鸟嘌呤）,碱基,核酸,核苷酸,嘧啶（胞、尿、胸腺嘧啶）,（,DNA,、,RNA,）,磷酸,DNA,和,RNA,是存在于细胞中的正常成分。,DNA,主要存在于细胞核中，少量（,2%,）存在于线粒体和叶绿体中；,RNA,主要存在于细胞质中，少量（,10%,）存在于核仁、核浆和染色体中。,核酸的含量与细胞大小无关，以生长旺盛的组织细胞中含量较多，如动物胰脏、脾脏、胸腺，植物的茎尖、根尖及各种分生组织等。,核酸药物的分类,一、具有天然结构的核酸类物质,如：,DNA,、,RNA,、肌苷、,ATP,、辅酶,A,、脱氧核苷酸、肌苷酸等。,获得：,微生物发酵或从生物资源中提取生产。,药理功能：,有助于改善机体的物质代谢和能量代谢平衡，加速受损组织的修复，促使机体恢复正常生理功能。,著名企业：,珍奥集团,、,GENTA,公司,核酸药物的分类,二、天然碱基、核苷、核苷酸的类似物或聚合物,如：三氟代胸苷、叠氮胸苷、拉米夫定（嘧啶类）、阿德福韦（嘌呤类）、,恩替卡韦,（第三代核苷类抗乙肝病毒药物）等。,获得：,由自然结构的核酸类物质通过半合成生产。,药理功能：,治疗病毒病如乙肝、肿瘤、爱滋病的重要药物，也是产生干扰素、免疫抑制剂的临床药物。,核酸类药物的生产方法,（一）核酸类药物的原材料,除病毒外，所有的动植物组织中都含有核酸类物质，包括大分子,DNA,和,RNA,、小分子的核苷酸、核苷、碱基等成分，但不同的组织中含量有所不同。,动物,胸腺,中,DNA,含量较多，是提取,DNA,的原料；,酵母,细胞中,RNA,含量最多，是提取生产,RNA,的主要原料。,核酸类药物的生产方法,（二）,DNA,和,RNA,的生产方法,1,、分离提取,核酸的生产一般采用提取法，即从粉碎、破裂的生物组织细胞中通过一定的方法获取总,DNA,或总,RNA,。,如需进一步的纯化，常用纯化方法如柱层析、凝胶电泳和,密度梯度超离心,。,、人工合成,获取大分子核酸的另一方法是人工合成，即利用化学的方法按照设定的核苷酸顺序逐一加入形成核酸。现已有,核酸合成仪,，但合成长度还有一定限制，并且该仪器价格昂贵。因此这种方法一般用于研究，不适合生产。,核酸类药物的生产方法,（三）核苷酸、核苷及碱基类似物的生产方法,酶解法、半合成法、发酵法,1,、酶解法,生产酵母，从酵母中提取,RNA,，,RNA,经青霉菌属或链霉菌属等微生物产生的酶进行酶解，制成各种核苷酸。,2,、半合成法,微生物发酵与化学合成并用。,3,、直接发酵法,采用营养缺陷型菌株或营养缺陷型兼结构类似物抗性菌株来发酵大量生产目的核苷或核苷酸。,核酸类药物的生产实例,（一）,DNA,的生产技术,提取原理,在细胞内的核酸通常是与蛋白质形成复合物,核糖核蛋白（,RNP,）和脱氧核糖核蛋白（,DNP,），这两种复合物在不同电解质溶液中的溶解度有较大差异。,RNA,pro.RNP,（核糖核蛋白）,DNA,pro.DNP,（脱氧核糖核蛋白）,00.14M NaCl,溶液,DNP,溶解度逐渐降低，,RNP,的溶解度很大；,0.14M0.5M NaCl,溶液,DNP,溶解度逐渐增加。,在制备,DNA,时，可利用,0.14M NaCl,溶液使,DNP,与,RNP,分开。由于,DNP,在浓盐溶液中的溶解度比稀溶液大得多，所以，首先采用浓盐溶液（,1,2M,）尽量抽提,DNP,，然后再去除杂蛋白。,核酸类药物的生产实例,工艺路线,抽提,猪脾脏,预处理,冷冻，绞碎,组织浆液,预处理,0.1M NaCl-0.5M,柠檬酸混合液，,离心,沉淀,1.71M NaCl,上清液,（,DNP,）,沉淀,（,DNP,）,溶解液,0.14M NaCl,沉淀物,白色纤维状,DNA,10%NaCl,上清液,（,DNA,）,氯仿,-,异戊醇,95%,乙醇,真空干燥,核酸类药物的生产实例,（二）,RNA,的生产,1,、来源：微生物,酵母,通常在细菌中,RNA,占,5,25,，在啤酒酵母中占,2.7,15,，在霉菌中占,0.728%,，面包酵母含,RNA 4.1,7.2,。,酵母菌体提取优点：,（,1,）收率高；,（,2,）提取容易。,核酸类药物的生产实例,、,RNA,的提取,等电沉淀法,酵母菌体,提取液,抽提清液,RNA,粗品,RNA,精品,稀,NaOH,，提取,中和，分离,洗涤、干燥,pH2.5,3,、工艺过程,（,1,）预处理：压榨、除水；（,2,）提取：,0.13%NaOH,，使细胞壁变性，使核酸从细胞内释放出来；（,3,）中和、除菌体；（,4,）分离：等电点法，调,pH2.5,，使,RNA,沉淀下来；（,5,）洗涤、干燥,核酸类药物的生产实例,（三）,ATP,制备,腺嘌呤前体,腺苷,AMP,ATP,枯草杆菌,160,（,Smr+Try,+Pur,）,微生物或化学转化,微生物,枯草杆菌,160,（,Sm,+tyr,+pur,）菌株，在添加腺嘌呤（由丙二氰化学合成）的培养基上培养，可以大量累积腺苷。,也可使用发酵法直接生产,ATP,，所用菌种是产氨短杆菌,ATCC6872,。,核酸类药物的生产实例,（四）辅酶,A,的生产,TCA,，除蛋白,新鲜猪肝,【,绞碎,】,肝浆,【,水，提取,】,提取液,滤液,GAM树脂,GAM-CoA,CoA,浓集液,LD-601-CoA,CoA,粉,HCl-NaCl,CoA,酸化液,HCl,，酸化,LD-601，再吸附,酸化,浓缩液,浓缩,上清液,沉淀物,丙酮沉淀,脱水干燥,核酸类药物的检测,1,、,DNA,含量测定,DNA,是磷酸和戊糖通过磷酸二酯键形成的长链，所以磷酸或戊糖的量正比例于,DNA,的量，可通过测定磷酸或戊糖的量来测定,DNA,的量，前者称为定磷法，后者称为定糖法。,（,1,）定磷法,磷酸与钼酸反应生成磷钼酸，再转变为钼蓝，吸收峰在,660nm,。,（,2,）定糖法,二苯胺法,酸性条件下，,DNA,与二苯胺共热，生成蓝色化合物，吸收峰,595nm,。,核酸类药物的检测,2,、,RNA,含量测定,（,1,）定磷法,660nm,；,（,2,）定糖法,地衣二酚（苔黑酚）法。,盐酸水解,RNA,，使核糖游离出来，并生成糠醛，与地衣二酚反应呈蓝绿色，在,670nm,处有最大吸收峰。,3,、核苷酸、核苷含量的测定,紫外分光光度法,它们都有特殊的紫外吸收曲线，选取合适的波长，可以根据其吸收值测定核苷、核苷酸的含量。,思考题,核酸类药物的种类和药理功能是什么？,DNA,、,RNA,、,ATP,及,HS-CoA,的生产方法。,如何检测核酸类药物？,核苷酸组分,腺嘌呤,腺嘌呤,鸟嘌呤,胞嘧啶,尿嘧啶,胸腺嘧啶,珍奥核酸,DNA,药物,核苷类药物,恩替卡韦,胸腺,酵母,ABI3948,核酸合成纯化仪,可自动完成,DNA,的合成，切割，脱保护，,OPC,纯化和定量等过程。在三个模块中同时进行合成、切割脱保护和纯化收集，,24,小时内可完成,48,个寡核苷酸片段的合成和纯化。,密度梯度离心机,