单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,狂犬病病毒（,dG,株）的批量生产及其检验,狂犬病病毒（dG株）的批量生产及其检验,报告主要内容,立 题 依 据,目 的 意 义,研 究 内 容,结 果 分 析,全 文 总 结,致 谢,报告主要内容 立 题 依 据,立 题 依 据,狂犬病俗称“疯狗病”，是由狂犬病病毒引起的人兽共患中枢神经系统传染病，是迄今为止人类唯一病死率高达,100%,的急性传染病。,在我国狂犬病仍然是一个严重的公共卫生问题，疫情的防治已刻不容缓。,立 题 依 据狂犬病俗称“疯狗病”，是由狂犬病病毒引起的人兽,立 题 依 据,我国动物用的狂犬病疫苗产品供应多年来一直依赖进口灭活疫苗和国产弱毒活疫苗，但是弱毒疫苗因为安全问题一直得不到广泛的应用。,有鉴于此，在国内尽快推出廉价高效而又稳定的国产动物用灭活疫苗，将会有效的抑制狂犬病的流行；从国情出发，此项研究显得重要和迫切。,立 题 依 据我国动物用的狂犬病疫苗产品供应多年来一直依赖进,G,蛋白是诱导产生中和抗体的蛋白，其与机体的免疫功能密切相关，因此将其作为研究对象。,华南农业大学兽医学院微生物实验室已成功拯救获得狂犬病毒,Hep-Flury-dG,嵌合病毒，对其进行生物学特性研究，结果表明,Hep-Flury-dG,株和,rHep-Flury,株比较，其致病性降低、免疫原性提高。,本论文就本实验室近年来自我研制的动物用狂犬病灭活疫苗（,dG,毒株）的批量生产及其检验过程做出总结。,立 题 依 据,G蛋白是诱导产生中和抗体的蛋白，其与机体的免疫功能密切相关，,目的和意义,本研究阐明了该,dG,株灭活疫苗的批量生产及其检验的方法步骤及结果，为今后的大规模生产制定了标准流程，为投入社会使用提供数据总结参考。,为进一步完善该,dG,株灭活疫苗奠定了数据基础。,目的和意义,研 究 内 容,种毒的,生产,种毒的,检验,扩大生产,质量检验,研 究 内 容种毒的种毒的扩大生产质量检验,结果分析,-,种毒的检验,病毒滴度检测：,共生产基础毒种,3,批，共计,100ml,，每批抽取样品，检测种毒滴度，置于荧光显微镜下观察荧光斑点，用,karber,方法计算结果。,结果分析-种毒的检验病毒滴度检测：共生产基础毒种3批，共计1,结果分析,-,种毒的检验,抗原相对含量检测：,在武汉生物制品研究所有限责任公司生产的已用抗狂犬病病毒糖蛋白单克隆抗体包被的酶标板中分别加入参考疫苗、亲代毒株（,rHEP-Flury,）、重组病毒（,dG,），计算疫苗中抗原含量的相对值,。,结果分析-种毒的检验抗原相对含量检测：在武汉生物制品研究所有,结果分析,-,种毒的检验,M,：,DNA Marker DL2000,；,1,、,2,、,3,：种毒,RNAPCR,产物,种毒,PCR,扩增鉴定：,结果分析-种毒的检验M：DNA Marker DL2000；,结果分析,-,种毒的检验,扩增,G-G,基因间的核苷酸序列,：,AAAGGGTGTTTGAGAGTTGGGGAGAGGTGTCATCCCCATGTGAACGGGGTGTTTTTCAATGGTATAATATTAGGGTCTGACGGCCATGTTCTAATCCCAGAGATGCAGTCATCCCTCCTCCAGCAACATATGGAGTTGTTGGAATCTTCAGTTATCCCCCTGATGCACCCCTTGGCAGACCCTTCTACAGTTTTCAAAGACGGTGATGAGGTTGAGGATTTTGTTGAAGTTCACCTCCCCGATGTGCATAAACAGGTCTCAGGAGTTGACCTGGGTCTCCCGAAATGGGGGAAGTATGTATTGATGATTGCAGGGGCCTTGATTGCCCTGATGTTGATAATTTTCCTGATGACATGTTGCAGAAGAGTCAATCGACCAGAATCTACACAAAGCAATCTTGGAGGGACAGGGAGAAATGTGTCAGTCCCTTCCCAAAGCGGAAAAGTCATATCTTCATGGGAGTCATATAAGAGTGGAGGCGAGACCAGACTGTGAAGGCCGGTCATCCTTTTGACACCTCAAGTCCAGAGGATAACCTCCTCCCGGGGAAAAAAACTAACACCTCTCGTACGATGGTTCCTCAGGTTCTTTTGTTTGCACCCCTCCTGGTTTCTCCATTGTGTTTCGGGAAGTTCCCCATTTACACGATACCAGACAAACTTGGTCCCTGGAGCCCTATTGACTTACACCATCTCAGCTGTCCAAATAACCTGGTTGTGGAGGACGAAGGATGTACCAACCTGT,结果分析-种毒的检验扩增G-G基因间的核苷酸序列：,结果分析,-,种毒的检验,种毒的纯净性检测：,按照,中华人民共和国兽药典,的要求，经病毒无菌检测，无菌落生成；经外源病毒检测，结果表明，基础种毒培养过程中无任何外源污染物质。产品纯净性合格，可以用于下一步扩大生产。,结果分析-种毒的检验种毒的纯净性检测：,结果分析,-,种毒的检验,种毒的免疫原性鉴定：,攻毒后，统计标准疫苗免疫以及,dG,株免疫的小鼠第,5d,至第,14d,死亡的情况和第,14d,呈典型脑症状（麻痹或痉挛）的情况，得出各组小鼠的死亡和存活数，按统计学方法分别获得参考疫苗以及,dG,株的累计死亡和累计存活数，进一步计算其死亡率。,结果分析-种毒的检验种毒的免疫原性鉴定：攻毒后，统计标准疫苗,结果分析,-,种毒的检验,种毒毒力检测：,攻毒后观察记录实验小鼠的死亡率，以统计学方法计算各稀释度死亡小鼠的百分率，按以,Reed-Muench,法计算毒种的乳鼠半数致死量（,LD,50,）。,结果分析-种毒的检验种毒毒力检测：攻毒后观察记录实验小鼠的死,种毒毒力检测,结果计算：,稀释因子是,10,，起始稀释是,10,-6,对数差,=,（,66.7-50,）,(66.7-20),lg10=16.746.71=0.36,因为小鼠死亡率随病毒稀释度增加而下降，所以,50,终点稀释小于起始稀释：,Log(50%,终点稀释的倒数,)=log(,起始稀释的倒数,)-,对数差,=log10,6,+0.36=6+.36=6.36,Log(50%,终点稀释,)=-6.36,，,dG,株：,50%,终点稀释（,LD,50,）,=10,-6.36,，,0.03ml,结果分析,-,种毒的检验,种毒毒力检测结果分析-种毒的检验,结果分析,-,扩大生产,结果表明：以,110,5,个细胞,/ml,的细胞浓度接入转瓶，细胞状态最好。,210,5,的细胞浓度次之，而以,0.510,5,的细胞浓度接入最差。,最佳条件摸索的结果,1,结果分析-扩大生产 结果表明：以1105个细胞/m,结果分析,-,扩大生产,结果表明：以,210,5,个细胞,/m,浓度培养,24h,，生长情况最佳，,110,5,浓度次之，而以,0.510,5,的细胞浓度生长情况最差，需培养,96h,才到达,90%,。,最佳条件摸索的结果,2,结果分析-扩大生产 结果表明：以2105个细胞/m,结果分析,-,扩大生产,结果显示：以,110,5,的细胞接入浓度产毒效果最好。,最佳条件摸索的结果,3,结果分析-扩大生产结果显示：以1105的细胞接入浓度产毒效,结果分析,-,扩大生产,结果表明：病毒接种量为,5%,、,2%,、,1%,的细胞于培养后,72h,培养滴度最高，病毒培养滴度不低于,1.010,8,FFU/ml,，达到制苗标准，三者差异不显著。但培养,96h,后病毒含量开始下降。,0.5%,接毒量需培养,96h,才能达到,110,8,FFU/ml,。,最佳条件摸索的结果,4,结果分析-扩大生产 结果表明：病毒接种量为5%、2%,结果分析,-,扩大批病毒的检验,批量生产病毒滴度：,共生产扩大批,5,批，共计,1000ml,，每批抽取样品，检测种毒滴度，置于荧光显微镜下观察荧光斑点，用,karber,方法计算结果。,结果分析-扩大批病毒的检验批量生产病毒滴度：共生产扩大批5批,批量生产病毒的免疫原性鉴定：,攻毒后，统计标准疫苗免疫以及,dG,株免疫的小鼠第,5d,至第,14d,死亡的情况和第,14d,呈典型脑症状（麻痹或痉挛）的情况，得出各组小鼠的死亡和存活数，按统计学方法分别获得参考疫苗以及,dG,株的累计死亡和累计存活数，进一步计算其死亡率。,结果分析,-,扩大批病毒的检验,批量生产病毒的免疫原性鉴定：攻毒后，统计标准疫苗免疫以及dG,批量生产病毒的纯净性检测,按照,中华人民共和国兽药典,的要求，经病毒无菌检测，无菌落生成；经外源病毒检验，结果表明，扩大批生产培养中无任何外源病毒的污染，产品纯净性合格。,结果分析,-,扩大批病毒的检验,批量生产病毒的纯净性检测结果分析-扩大批病毒的检验,全 文 总 结,1,、通过,PCR,产物测序鉴定表明，即将进行培养生产的病毒为含双,G,基因的重组狂犬病病毒（,dG,株），确保为生产疫苗的目的毒株。,2,、,dG,株在扩大培养阶段，以培养,24h110,5,个细胞,/ml,的细胞浓度接入转瓶，细胞状态最好，病毒接种量为,1%,培养收获时间为,3d,，今后的大规模生产将按照这个方法进行，保证生产的高效率。,全 文 总 结1、通过PCR产物测序鉴定表明，即将进行培养生,全 文 总 结,3,、,dG,株种毒及经培育扩大生产后半成品的滴度要求至少是,1.010,8,。,4,、培养的,dG,株做成疫苗后的相对效力不能低于,2.0IU/mL,。,全 文 总 结3、dG株种毒及经培育扩大生产后半成品的滴度要,致 谢,本论文是在导师郭霄峰教授的悉心指导与殷切关怀下完成的。从本科到研究生阶段，导师无论在工作上还是在生活上，都给予了我无微不至的关怀和帮助。导师崇高的敬业精神和高尚的人格魅力，值得我永远学习和效仿；导师渊博的知识，严谨的治学态度，开阔的科研视野，使我终身受益，我将永远铭记在心。在此，对恩师致以衷心的感谢和最崇高的敬意！,致 谢本论文是在导师郭霄峰教授的悉心指导与殷切关怀下完,致 谢,感谢魏文康导师对我实验的指导、关怀和帮助！,感谢广州市华南农大生物药品有限公司的薛素强硕士及其同事对我论文内容的指导与意见！,在实验进行的过程中，感谢微生物研究室林颖仪实验员在细胞培养、病毒制造与效价测试过程中的指导与帮助！,致 谢感谢魏文康导师对我实验的指导、关怀和帮助！,致 谢,对以上提及和未提及的所有关心、支持、帮助我的老师、同学、朋友一并致以最诚挚的谢意！,最后特别感谢我的爱人徐铮老师和我的父母们在生活、学习和研究中对我的全力支持、理解和为我付出的每一分辛苦！,致 谢对以上提及和未提及的所有关心、支持、帮助我的老师,谢 谢 各 位！,请多提宝贵意见！,谢 谢 各 位！,结果分析,-,种毒的免疫原性鉴定结果,对数差,=,（,50,40.9,）,(80.8,40.9)lg5=9.139.90.699=0.16,Log(50%,终点稀释的倒数,)=log(,起始稀释的倒数,)+,对数差,=log25+0.16=1.4+0.16=1.56,Log(50%,终点稀释,)=-1.56,，,50%,终点稀释（,ED,50,）,=10,-1.56,（,=1,：,36,）,结果分析-种毒的免疫原性鉴定结果 对数差=（5040.9）,结果分析,-,种毒的免疫原性鉴定结果,对数差,=,（,50,21.88,）,(53.57,21.88)lg5=28.1231.690.699=0.62,Log(50%,终点稀释的倒数,)=log(,起始稀释的倒数,)+,对数差,=log25+0.62=1.4+0.62=2.02,Log(50%,终点稀释,)=-2.02,50%,终点稀释（,ED,50,）,=10,-2.02,（,=1