单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2016-12-16,#,兽药残留样品前处理技术,兽药残留样品前处理技术,第1页,目录,contents,01,概述,02,样品预处理,03,提取与净化,04,实例分析,兽药残留样品前处理技术,第2页,01,PART,概述,Introduction,兽药残留样品前处理技术,第3页,浓缩,净化,提取,03,02,01,样品前处理,是指样品制备和对样品中待测组分进行提取、净化和浓缩过程。样品前处理目标是消除基质干扰，保护仪器，提升检测方法灵敏度、选择性、准确度、精密度。,概述,兽药残留样品前处理技术,第4页,基体复杂,各目标化合物,性质差异大,残留浓度低,检测限越,来越严格,01,02,03,04,残留分析特点,兽药残留样品前处理技术,第5页,SAMPLE TYPES,兽药残留分析中，最常见生物样品是组织样品,和禽蛋,，其次是奶、血液和尿液样品。,样品类型,兽药残留样品前处理技术,第6页,肌肉中水分约占,75%,，蛋白质（肌浆蛋白、肌原蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白）占,19%,，脂肪（中性脂肪、脂肪酸和磷脂）占,2.5%,，糖类占,1.2%,，以及一些无机盐、维生素和酶类。肌浆蛋白（肌红蛋白、糖解酶）可溶于水，肌原蛋白（肌球蛋白、肌动蛋白）溶于浓盐水，胶原蛋白和弹性蛋白（结缔组织）在上述溶剂中均不溶。,动物组织,兽药残留样品前处理技术,第7页,禽蛋包含蛋黄和蛋清。蛋黄含水量约,50%,、蛋白质,16.5%,、脂肪,33%,、糖类,0.2%,，以及一些无机盐、维生素和酶类（淀粉酶、脂肪酶、磷酸酶、肽酶和过氧化氢酶）。蛋清含水量达,88%,，蛋白质,10.5%,和极少许碳水化合物和脂肪。,与蛋清相比较，蛋黄基础上为疏水性环境，低极性药品残留较多。假如需要分别测定蛋黄和蛋清中残留，最好将刚产出后蛋分离蛋黄和蛋清，防止药品由蛋黄向蛋清扩散。,禽蛋,兽药残留样品前处理技术,第8页,奶中还含有大量由酪蛋白或脂蛋白组成束胶体系，当酸化或加热时，束胶结构解体，蛋白质沉淀析出,。,非解离性或极性较低药品易由血浆向奶中扩散，造成奶中残留。与血浆样品类似，奶中药品可与蛋白结合。,牛奶含水量约,87%,，蛋白质（以酪蛋白为主）为,3.3%,，脂肪（甘油三酯）为,3.7%,，糖类（乳糖）为,4.7%,，以及一些无机盐、维生素和酶类（过氧化物酶、脂肪酶等）。,奶样,兽药残留样品前处理技术,第9页,血液由血浆和血清组成,。,血浆和血清化学成份与组织液相近，测定血浆或血清中药品浓度，比全血更能反应作用个别药浓改变，测定方法普通也可相互通用。若血浆中含有抗凝剂对测定有影响，则应使用血清样品。通常药品在血浆中均与血浆蛋白（白蛋白、球蛋白、糖蛋白、脂蛋白）发生一定程度结合，一些药品蛋白结合率甚至可达,90%,以上。所以在萃取之前，必须将结合态药品分离出来。,血样,兽药残留样品前处理技术,第10页,尿中药品大多呈结合状态，主要以葡萄苷酸和硫酸酯结合物存在，所以不论直接测定或萃取分离之前，都必须将结合态药品水解，使药品游离处理。,尿液主要成份是水、尿素及盐类。在全部体液样品中，尿样最轻易取得，而且样品最多，内含药品（母体药品及代谢物）浓度高；正常尿液中仅含微量蛋白质，不需要去蛋白处理。,尿样,兽药残留样品前处理技术,第11页,02,PART,样品预处理,Sample Pretreatment,兽药残留样品前处理技术,第12页,常见结合物水解方法有,酸水解,和,酶水解,药品在体内经第二相代谢反应之后，常形成葡萄糖苷酸、硫酸酯及磷酸酯等结合物。以结合状态存在药品多存在于尿中，但也存在于肝脏、肌肉及血液中。,Lorem ipsum dolor sit amet consectetur adipisicing elit,结合物水解,兽药残留样品前处理技术,第13页,酸水解,有药品结合物则必须采取较猛烈条件，如加入,3 mol/L,盐酸溶液后还必须煮沸,1h,，水解后样品呈强酸性，必要时可用碱液调整,pH,后再进行萃取。,酸水解通常使用无机酸,（盐酸），,至于加入盐酸浓度、酸化时间以及是否需要加热等，随药品性质而异，但最终应经过试验确定。,兽药残留样品前处理技术,第14页,酶水解,-,葡糖苷酸酶可专门水解药品葡萄糖醛酸苷，芳基硫酸酯酶和磷酸酯酶分别水解药品硫酸酯和磷酸酯。也可用几个酶混合物，将生物样品中药品葡萄糖醛酸酐及硫酸酯同时水解。,酶水解是专属性很强水解结合物方法。通常使用水解酶是,-,葡糖苷酸酶、芳基硫酸酯酶、磷酸酯酶等,。,兽药残留样品前处理技术,第15页,蛋白质,生物样品如肝脏、肾脏、血浆等含有大量蛋白质，它们能结合药品，所以对于一些药品检测，必须先将与蛋白质结合药品游离之后再作深入处理。,除蛋白质,兽药残留样品前处理技术,第16页,除,蛋白过程是将蛋白质变性处理后，把与蛋白质结合药品解离出来，离心分离出去蛋白。通常除蛋白方法是在含蛋白样品中加入适当沉淀剂或变性剂，使蛋白质脱水而沉淀（如有机溶剂、中性盐），有是因为,和,蛋白质形成不溶性盐而析出（如一些酸类：三氯乙酸、高氯酸、磷酸、苦味酸,）,去蛋白原理,兽药残留样品前处理技术,第17页,有机溶剂沉淀剂,甲醇与蛋白形成絮状沉淀易于离心分离，得到澄清上清液；乙腈与蛋白形成致密沉淀，易离心除去，沉淀效率较甲醇高。使用时应加入足量沉淀剂，通常加入量为样品体积,1.5,2,倍,。,兽药残留样品前处理技术,第18页,酸沉淀剂,常见酸性沉淀剂有三氯乙酸和高氯酸，其它还有钨酸、钼酸、磷钨酸、磷钼酸和苦味酸等。酸性沉淀剂能同蛋白质阳离子形成不溶性盐而沉淀，必要条件是溶液,pH,要低于蛋白等电点。,兽药残留样品前处理技术,第19页,LOREM IPSUM,一些无机盐如硫酸铵、硫酸钠和氯化钠等，能使蛋白质胶体脱水并中和其电荷，使蛋白质失去胶体性而沉淀下来。无机盐中以硫酸铵最常见。,盐沉淀剂,兽药残留样品前处理技术,第20页,03,PART,提取与净化,Extraction&Cleanup,兽药残留样品前处理技术,第21页,提取净化方法,液,-,液萃取,基质固相分散技术,超临界流体萃取,固相微萃取,免疫亲和色谱,固相萃取,兽药残留样品前处理技术,第22页,04,01,02,03,经过萃取可将被测组分自大量内源性物质中分离出来，降低杂质对测定干扰,操作简单快速、经济实用,可一次进行多个样品萃取,可将萃取液蒸发，使组分富集,液,-,液萃取,经典,兽药残留样品前处理技术,第23页,溶剂极性,1,依据相同相溶原理，极性组分易溶于极性溶剂，反之亦然，应依据被测组分极性选择相同极性溶剂,2,溶剂沸点,萃取分离后有机相通常需要旋蒸至干，所以萃取溶剂沸点就不应靠近或高于水沸点，不然挥发困难,3,溶剂毒性,使用对人体有害萃取溶剂时，应在通风橱内进行,4,与水互溶性,有溶剂如乙醚，萃取后可混入大约,1.2%,水分，所以伴随带入一些水溶性杂质,液,-,液萃取常见有机溶剂有甲醇、乙腈、丙酮、氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、乙醚、叔丁基甲醚、乙酸乙酯、苯、甲苯、正己烷。,兽药残留样品前处理技术,第24页,阳离子药品,阴离子药品,阳离子药品配正确离子对试剂则为阴离子，其中以烷基磺酸类（,RSO,3,H,）为最常见，实际起配对作用是其阴离子（,RSO,3,-,），,R,为烷基，其碳链越长，生成离子对络合物脂溶性越高。,一些酸性或碱性较强有机药品在体液中呈离解状态，成为亲水性较强带电离子，即使控制,pH,也不能抑制它们电离，不能用有机溶剂将其自体液中提取出来。,阴离子药品配正确离子对试剂主要为烷基季铵类化合物，可用通式,R,4,N,+,X,-,表示，,X,-,可为酸根或氢氧根，,R,为烷基。烷基碳链长度常见,C,4,C,12,，甚至可选取,C,20,，碳链越长，则生成离子对络合物脂溶性越高。,兽药残留样品前处理技术,第25页,固相萃取是一个基于色谱分离样品前处理方法。固相萃取包含固相（含有一定官能团固体吸附剂）和液相（样品及溶剂）。液体样品在正压、负压或重力作用下经过装有固体吸附剂固相萃取装置。因为固体吸附剂含有不一样官能团，能将特定化合物吸附并保留在,SPE,柱上。,固相萃取（,SPE,）,吸附目标物,吸附杂质,兽药残留样品前处理技术,第26页,基质固相分散技术,基质分散固相萃取（,MSPD,，,matrix solid-phase dispersion,），其原理是将涂渍有,C,18,等各种聚合物担体固相萃取材料与样品一起研磨，得到半干状态混合物并将其作为填料装柱，然后用不一样溶剂淋洗柱子，将各种待测物洗脱下来。其优点是浓缩了传统样品前处理中样品匀化、组织细胞裂解、提取、净化等过程，不需要进行组织匀浆、沉淀、离心、,pH,调整和样品转移等操作步骤，防止了样品损失。,兽药残留样品前处理技术,第27页,超临界流体含有类似气体较强穿透力和类似于液体较大密度和溶解度，含有良好溶剂特征，可作为溶剂进行萃取、分离单体。,超临界流体萃取,兽药残留样品前处理技术,第28页,固相微萃取,固相微萃取（,SPME,）与固相萃取原理相同，其基础标准也是“相同相溶原理”，主要依据分析物质分子量（挥发性）与极性。纤维头上薄膜由极性聚丙烯酸酯、聚乙二醇，或非极性聚二甲硅氧烷组成。,兽药残留样品前处理技术,第29页,04,PART,实例分析,Analysis of Example,兽药残留样品前处理技术,第30页,进出口动物源食品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林残留量测定,液相色谱,-,质谱,/,质谱法,SN/T 1924-,兽药残留样品前处理技术,第31页,-,受体激动剂是指含氮激素中苯乙胺类药品。苯乙胺类药品含有苯乙醇胺结构母核，苯环上连接有碱性,-,羟胺（肿胺）侧链。按照苯环上取代基差异，可将,PEAs,分为苯胺型和苯酚型。,-,受体激动剂,药品,R,1,R,2,R,3,R,4,克仑特罗,-Cl,-NH,2,-Cl,-C(CH,3,),3,莱克多巴胺,-H,-OH,-H,沙丁胺醇,-CH2OH,-OH,-H,-C(CH,3,),3,特布他林,-OH,-H,-OH,-C(CH,3,),3,兽药残留样品前处理技术,第32页,称取,5g,试样，添加,50,L,内标工作液，加入,20mL,乙酸铵缓冲溶液（,pH5.2,），均质,1min,8000r/min,离心,5min,，搜集上清液，加入,20mL,正己烷，振荡脱脂,加入,40,L,-,葡萄糖醛苷酶,/,芳基硫酸酯酶，混匀，,37,酶解,16h,。,1r/min,离心,5min,，下层水相过滤，待净化,01,02,03,04,提取,兽药残留样品前处理技术,第33页,依次用,3 mL,甲醇、,3mL,水和,3mL 0.1mol/L,盐酸水溶液活化,依次用,3mL 0.1mol/L,盐酸水溶液、,3mL,水、,3mL50%,甲醇水溶液和,3mL,正己烷洗涤,3mL,（乙酸乙酯,/,甲醇,/5mL,氨水，,50:45:5,）洗脱,净化,活化,洗涤,洗脱,兽药残留样品前处理技术,第34页,HPLC-MS/MS,测定,洗脱液在,45,下氮气吹干，加入,1mL0.1%,甲酸溶液溶解残渣，样液过,0.22,m,滤膜后，上机,。,浓缩,兽药残留样品前处理技术,第35页,感激您观看,Thanks For your Watching,！,兽药残留样品前处理技术,第36页,