单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,引物设计,之浅谈,PCR,过程,内容,引物设计的原那么,Primer premier 5.0的使用,植物表达载体引物设计,原核表达载体引物设计,酵母表达载体引物设计,一、引物设计的原那么,引物长度,一般为,15-30,个核苷酸,.,在做长片段,PCR,或做某些特殊的,PCR,时应使用较长的引物，但最多不超过,50,个核苷酸。,同一碱基连续出现不应超过,5,个,GC,含量一般,40-60%,GC,含量太低导致引物,Tm,值较低，使用较低的退火温度不利于提高,PCR,的特异性,GC,含量太高也易于引发非特异扩增。,碱基分布的均衡性,引物,Tm,值,一般要求：55-65。,计算：,对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算,对于较长引物，Tm值那么需要考虑热动力学参数，从“最近邻位的计算方式得到，这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。,Tm=H/(S+R*ln(C/4)+16.6 log(K+/(1+0.7 K+)-273.15,引物二级结构,引物二聚体,尽可能防止两个引物分子之间3端有较多碱基互补,发夹结构,尤其是要防止引物3端形成发夹结构，否那么将严重影响DNA聚合酶的延伸。,引物,3,端,引物的延伸从3端开始，因此3端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否那么不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败。,3端的末位碱基会导致不同的错配机率,引物,5,端,引物5端可以有与模板DNA不配对碱基，在5端引入一段非模板依赖性序列。,5端加上限制性核酸内切酶位点序列酶切位点5端加上适当数量的保护碱基。,5端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。,5端标记放射性元素或非放射性物质如生物素、地高辛等。,总结,1、长度为15-30bp,2、防止有聚嘌呤或聚嘧啶，尤其是端,3、Tm值：55-65,4、防止二级结构,5、3端末位为TGCA,二、引物设计软件,Primer Premier 5.0,生物软件网购置,下载，安装后，用文本编辑器翻开WIN.INI，将vspace=DU改为vspace=PU，并将其改成只读，便可以使用全部功能。,三、植物表达载体构建引物设计,设计引物步骤,1,、对基因进行酶切位点分析,2,、选择适当的表达载体及酶切位点,3,、根据上、下游序列设计引物,举例,lipid transfer protein,ATGGCAGGCTCTTCCGCCCTGTTCAAGCTCGCTTGCTTAGTTGCCGCGTTCATGATTGTATCTGCGCCACATGCAGAAGCTGCCATATCATGCGGTACCGTCGTCTCAAAGCTCGCCCCATGCCTCGGCTTTCTCAGGGGCGGCGGTTCCCCACCACCTGCTTGTTGTAGTGGGATTAGAAACCTTCAAAGCATGGCTAGGAGTACACCCGATCGTCAAGCTGCTTGCGGGTGCTTGAAGTCTGCTTCGGCTGGTGTTAATATGCGTAATGCTGCCGCTCTTCCCGGTAAATGTGGTGTGAACATCGGTTACCCAATCAGCAGGAGCGTTGACTGCTCCAGGGTGAAGTGA,Enzymes that do not cut:,ApaLI,ApoI,AscI,AseI,AsiSI,AvaI,AvaII,AvrII,BamHI,BanII,BbeI,BbsI,BbvCI,BceAI,BcgI,BcgI,BciVI,BclI,BfrBI,BglI,BglII,BlpI,Bme1580I,BmrI,BmtI,BplI,BpmI,Bpu10I,BpuEI,BsaI,BsaAI,BsaBI,BsaHI,BsaWI,BsaXI,BseRI,BseYI,BsgI,BsiHKAI,BsiWI,BsmI,BsmFI,Bsp1286I,BspEI,EcoICRI,Eco57MI,EcoNI,EcoO109I,EcoRI,EcoRV,FalI,FokI,FseI,FspI,FspAI,HaeII,HaeIII,HgaI,Hin4I,Hin4I,HincII,HindIII,HinfI,HpaI,HpaII,HphI,Hpy188I,HpyCH4IV,KasI,MaeIII,MfeI,MluI,MlyI,MmeI,MscI,MseI,MslI,NaeI,NarI,NciI,NcoI,NdeI,NgoMIV,NheI,NotI,NruI,NsiI,PacI,PciI,PleI,PmeI,PmlI,PpiI,PpiI,PpuMI,PshAI,PsiI,PspGI,PspOMI,PsrI,PsrI,PstI,PvuII,RsrII,SacI,SacII,SalI,SanDI,Sau96I,SbfI,ScaI,ScrFI,SexAI,SfcI,SfiI,SfoI,SgrAI,SmaI,SmlI,SnaBI,SpeI,SphI,SrfI,SspI,StuI,StyI,StyD4I,SwaI,TaiI,TaqI,TaqII,TaqII,TfiI,Tsp45I,Tsp509I,TspGWI,Tth111I,XbaI,XcmI,XhoI,XmaI,XmnI,ZraI,植物表达载体,pROK,确定酶切位点,BamH:,GGA TCC,Sac,：,GAGCTC,XbaI BamHI SmaI KpnI SacI,35S,同时在正链上设计,3,端及,5,端引物,上游：,5-,ATGGCAGGCTCTTCCGCCCT,-3,下游,:,-,ACTGCTCCAGGGTGAAGTGA,-,加酶切位点：,BamH:,L 5-,GGA,TCC,ATGGCAGGCTCTTCCGCCCT,SacI,：,R 5-,ACTGCTCCAGGGTGAAGTGA,GAGCTC,加保护碱基酶的边际效应：,L-5TAC GGA TCCATGGCAGGCTCTTCCGCCCT3,R-3 ACTGCTCCAGGGTGAAGTGAGAGCTC GTAC5,最后引物序列：,L：5-GTAC GGA TCCATGGCAGGCTCTTCCGCCCT,R：5-GTACGAGCTCTCACTTCACCCTGGAGCAGT,原核表达载体引物设计,原核表达载体特点,原核表达载体举例,pGEX-4T-2 系列原核表达载体携带谷胱甘肽S转移酶GST基因,编码蛋白分子量26.0kD,假设外源片段正确插入载体pGEX多克隆位点后将表达GST融合蛋白。,pET28a 特点是在外源蛋白的端可编码6个组氨酸残基,6个组氨酸对表达蛋白的活性和结构影响很少,但由于组氨酸的咪唑环能与金属Ni形成螯合物,因此利用Ni-NTA树脂可以很方便地将外源蛋白从细菌蛋白中别离出来。载体蛋白分子量约3.5kD。,本卷须知:,产生融合蛋白，基因的插入不能影响蛋白的正常翻译,多克隆位点,：,Bam,H I,Eco,R I,Sac,I,Sal,I,Hind,III,Not,I,Xho,I,GGA TCC GAA TTC GAG CTC CGT CGA CAA GCT TGC GGC CGC ACT CGA G,Gly Ser Glu Phe Glu Leu Arg Arg Gln Ala Cys Gly Arg Thr Arg A,正向,：,Bam,H I:,5-,GGA TCC,ATG GCA GGC TCT TCC GCC CTG TT-3,Sac,I:,5-,GAG CTC,ATG GCA GGC TCT TCC GCC CTG TT-3,Sal,I:,5-,GT CGA C,ATG GCA GGC TCT TCC GCC CTG TT-3,Sal,I:,5-,GT CGA,C,AA,ATG GCA GGC TCT TCC GCC CTG TT-3,Hind,III:,5-,AA GCT,T,GC,ATG GCA GGC TCT TCC GCC CTG TT-3,反向,：,Xho,I,:3-,TTGACTGCTCCAGGGTGAAG,A,CT CGA G,-5,无终止密码子,加保护碱基酶的边际效应：,L,：,5-,GTAC,GGA TCC,ATG GCA GGC TCT TCC GCC CTG TT-3,R,：,3-,TTGACTGCTCCAGGGTGAAG,A,CT CGA G,GTAC,-5,最后引物序列：,L,：,5-,GTAC,GGA TCC,ATG GCA GGC TCT TCC GCC CTG TT-3,R,：,5-,GTAC,CTCGAG,T,CTT CAC CCT GGA GCA GTC AA-,3,酵母表达载体引物设计,酵母表达载体的特点,酵母表达引物设计,目的片段应该含有,Kozak,翻译起始序列,A,NN,ATG,G,ATGGCAGGCTCTTCCGCCCTGTTCAAGCTCGCTTGCTTAGTTGCCGCGTTCATGATTGTATCTGCGCCACATGCAGAAGCTGCCATATCATGCGGTACCGTCGTCTCAAAGCTCGCCCCATGCCTCGGCTTTCTCAGGGGCGGCGGTTCCCCACCACCTGCTTGTTGTAGTGGGATTAGAAACCTTCAAAGCATGGCTAGGAGTACACCCGATCGTCAAGCTGCTTGCGGGTGCTTGAAGTCTGCTTCGGCTGGTGTTAATATGCGTAATGCTGCCGCTCTTCCCGGTAAATGTGGTGTGAACATCGGTTACCCAATCAGCAGGAGCGTTGACTGCTCCAGGGTGAAGTGA,5,端引物设计：,Bam,HI,：,GGATCC,CCTAGG,5-,ATG,GCA GGC TCT TCC GCC CTG TT-3,5-,GGATCC,ATG,GCA GGC TCT TCC GCC CTG TT-3,5-,GGATCC,ACG,ATG,GCA GGC TCT TCC GCC CTG TT-3,5-ATCG,GGATCC,ATG,G,CA GGC TCT TCC GCC CTG TT-3,能编码一个氨基酸,没有要求,酵母表达引物设计,3,端引物设计的方法：,Xho,I,：,C TCGAG,GAGCT C,3-TTGACTGCTCCAGGGTGAAGTGA-5,3-TTGACTGCTCCAGGGTGAAGTGA,C TCGAG,-5,3-TTGACTGCTCCAGGGTGAAGTGA,C TCGAG,ATCG,-5,5-,CGAT,CTCGAG,TCACTTCACCCTGGAGCAGTCAA,-3,谢谢,