单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,色谱分离基本原理,“两相分配，相似相溶”,色谱分离基本原理“两相分配，相似相溶”,1,色谱柱结构,色谱柱有方向性，主要与装填技术有关。,筛板的内部孔形态会影响柱效,色谱柱结构色谱柱有方向性，主要与装填技术有关。,2,规格,内径,长度,粒径,碳载量,孔径,比表面积,材质,封端,表观规格：柱管材质，填料分类，尺寸，粒径,隐藏信息：碳载量，,平均,孔径，比表面积，封端，键合类型，,pH,范围，最大耐压，筛板孔径等,Waters XBridge Shield RP 18 4.6*250mm,5um,柱效,拖尾,载样量（体积）,载样量（浓度）,分离度,回收率,你能正确连接它们吗？,规格内径表观规格：柱管材质，填料分类，尺寸，粒径,3,填料,硅胶,等载体（正相色谱）,硅胶,+,键合相（反相色谱）,聚合物,+,键合相（离子交换，手性色谱柱等）,整体柱（空间排阻色谱等）,填料硅胶 等载体（正相色谱）,4,反相色谱,C18,填料,反相色谱C18填料,5,硅胶,注意：,硅胶 颗粒大小分布,金属残留,内部孔径,实心核颗粒,硅胶注意：,6,四乙氧基硅烷,(TEOS),硅甲基嵌入型聚乙氧基硅烷,(MPEOS),甲基三乙氧基硅烷,(MTEOS),改性硅胶,四乙氧基硅烷硅甲基嵌入型聚乙氧基硅烷(MPEOS)甲基三乙,7,硅胶快速溶解,严重的柱失效,柱寿命短暂,因嵌入硅甲基的阻挡,颗粒表面溶解速度明显减缓,柱寿命大大延长,pH,范围可达,111,普通硅胶柱,waters,改性硅胶柱,碱性条件下硅胶溶解,硅胶快速溶解 因嵌入硅甲基的阻挡,颗粒表面溶解速度明显减,8,单、双、三官能团键合,三官能团键合,二官能团键合,单官能团键合,键合,碳载量,影响残留硅羟基比率,键合相流失率,键合密度,单、双、三官能团键合三官能团键合二官能团键合单官能团键合键合,9,常见键合相,主要,作用机理,疏水,疏水,-,疏水,疏水,氢键,-,氢键,氢键,阳离子交换,阴离子交换,常见键合相 主要作用机理疏水疏水-疏水氢键氢键氢键阳离子,10,空间位阻：异丙基硅氧烷，异丁基硅氧烷,增加,pH,范围，但有限，一般,19,空间位阻,Agilent,Phenomenex,空间位阻：异丙基硅氧烷，异丁基硅氧烷空间位阻Agilent,11,空间位阻,抗水解,Agilent XDB,空间位阻抗水解Agilent XDB,12,极性嵌入,Waters “Shield”,极性嵌入Waters “Shield”,13,内嵌极性基团固定相：水表面层可能机理,水“屏蔽,”,层,改善与水的浸润性100%水溶液兼容,降低了碱性化合物的保留,降低了拖尾现象,屏蔽了带负电的硅羟基,极性基团增加了表面层水的浓度,内嵌极性基团固定相：水表面层可能机理水“屏蔽”层改善与水的,14,与键合相的疏水性作用,双重保留机理:,1).,与键合相的的疏水性作用;2).与残余硅醇基间的离子交换作用,O-,Si,O-,Si,O,-,O-,Si,O-,Si,O,-,O-,Si,O,-,O-,Si,O-,Si,O-,Si,O,-,O-,Si,O-,Si,O-,Si,O-,Si,OH,O-,Si,O-,Si,OH,O-,Si,OH,O-,Si,O-,Si,O-,Si,OH,O-,Si,O-,Si,(,CH,3,),2,HN,+,(,CH,3,),2,HN,+,当流动相,pH,值小于3时,硅醇基呈中性(未解离),Base,Base,对碱性化合物的保留及严重拖尾,两实验使用相同的传统,C8,硅胶柱,离子交换作用,碱性分析物在硅胶柱上的拖尾机理,当流动相为,pH,6-8时,硅醇基带负电性(大部解离),与键合相的疏水性作用双重保留机理:1).与键合相的的疏水,15,既然,pH 3,时硅醇基离解受抑制，为何不在所有情况下采用酸性条件进行分离,?,低,pH,可导致分离选择性的丧失!,-,碱性基团离子化，极性增加,pH 7.0,pH 2.0,amitriptyline,nortriptyline,既然pH 8,时,许多,C18,硅胶基质过早地丧失柱效,由于填料颗粒溶解,色谱柱内产生空隙,随着键合相覆盖率的增加，色谱柱寿命延长,低,pH,实验,pH 2,时,许多,C18,硅胶基质过早地丧失柱效,由于键合相之水解作用,被测物丧失保留行为,使用三官能团键合相可获得最佳的稳定性,宽,pH,柱,pH对填料稳定性的影响高pH实验宽pH 柱,26,宽,pH,值色谱柱的几种类型,Agilent,双齿键合,宽,pH,柱,Waters,杂化颗粒,宽pH值色谱柱的几种类型Agilent 双齿键合宽pH 柱W,27,基质溶解度,(,ppm),1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12,240-,220-,200-,180-,160-,140-,120-,100-,80-,60-,40-,20-,0-,pH,基质溶解度曲线,传统硅胶柱适用范围,pH 2-7,各种基质的液相柱在高,pH,中溶解速率的比较,液相柱基体材料的溶解导致柱前端形成空腔，由此而造成色谱峰畸形、分叉。,现代超纯硅胶柱适用范围,pH 2-8,宽,pH,值色谱柱,适用范围,pH 1-12,基质溶解度(ppm)1 2 3,28,柱效下降，柱压升高的原因,键合相流失,保留时间的急剧下降是因为疏水塌陷,硅胶溶解坍塌,死吸附，硅胶内孔堵塞,筛板堵塞,稀释剂与流动相差异大或流动相急剧变化导致的柱内析晶,压力波动大致柱床松动，涡流效应增大,Q,柱效下降，柱压升高的原因 键合相流失Q,29,我的色谱柱寿命为何不长?,您是否有恰当的样品前处理手段,?,样品前处理(净化和富集,),的好坏不仅影响分析结果的灵敏度和可靠性，而且直接影响色谱柱的寿命,您的色谱柱是否有适当的保护措施?,在线过滤器,保护柱,您的色谱柱是否曾暴露在过于剧烈的分离条件?,使用某些对填料基体有腐蚀性的高浓度缓冲盐,(,如在中性或碱性,pH,区域使用,高浓度缓冲盐的磷酸盐或硼酸盐,),柱温过高,将色谱柱暴露在极端,pH,的流动相中,Q,我的色谱柱寿命为何不长?您是否有恰当的样品前处理手段?Q,30,选择性与,pH,影响带离子型官能团的待测物,如：胺，羧酸及酚类等,pH,不影响不能发生电离的中性物质的保留,大多数药物含有一个或多个离子型官能团,pH,变化引起的选择性变化最大,Q,化合物从离子化状态变化到非离子化状态其保留因子变化10 到 30倍,上述变化相当于有机溶剂的比例变化20%,pH,带来最显著的选择性变化,pH,是方法开发最强有力的选择性调节工具,选择性与pH影响带离子型官能团的待测物Q化合物从离子化状态变,31,重要的方法开发为何要从新色谱柱开始？,随使用条件和样品洁净度的不同，多数色谱柱在使用过程中可发生化学污染、表面状态改变、基体材料部分溶解等等潜在变化。,此类改变可导致柱内填料的活化或钝化，使其对某些化合物的分离选择性加强或变劣。此类特殊分离选择性常常是无法重复的。,在此类旧色谱柱建立起来的方法将无法在新柱和其他旧色谱柱上得以重现，造成未来可能需要重新开发方法或进行大量针对仪器系统、色谱柱和流动相的不必要的诊断工作。,Q,重要的方法开发为何要从新色谱柱开始？随使用条件和样品洁净度,32,反相色谱柱的选择小结:,常规应用,现代高纯硅胶色谱柱：,优点：峰形好，重现性高，寿命长,限制：,pH 2-8,流动相中含有大量水溶液,采用,AQ,技术：,优点：在含有大量水溶液（100,水溶液）,流动相中,性能稳定：峰形好,Q,使用宽,pH值或高温条件 如生物碱分离,宽,pH,值色谱柱：,pH1-12,优点：,pH范围宽，高温条件下填料稳定性好，色谱峰,形好，寿命长,快速分离或采用质谱检测器:窄内径/小颗粒/短柱,反相色谱柱的选择小结:常规应用 Q使用宽pH值或高温条件,33,