单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,11/16/2024,1,玉米籽粒花青素提取和分析方法,8/2/20231玉米籽粒花青素提取和分析方法,11/16/2024,2,花青素是植物中的主要呈色物质，属于类黄酮化合物,自然状态下很少以游离态存在，常与一个或多个多糖通过糖苷键形成糖苷,已知有20多种花青素，植物中常见的有六种：天竺葵色素、矢车菊色素、飞燕草色素、芍药色素、牵牛花色素、锦葵色素（其最大可见光吸收波长分别为494、506、508、506、508和510 nm,）,8/2/20232花青素是植物中的主要呈色物质，属于类黄酮化,11/16/2024,3,花青素的生理功能,消除自由基、抗氧化,紫玉米花色苷具有很高的抗氧化活性和抗 菌活性，甚至高于蓝莓的抗氧化活性。,抗诱变、肿瘤、过敏,抑制食品诱变剂，对结肠癌细胞有抑制作用,降血脂,8/2/20233花青素的生理功能消除自由基、抗氧化,11/16/2024,4,花青素的结构特点,现已查明,天然花色苷糖苷配基的基本,结构为,3,5,7-,三羟基,-2-,苯基苯并吡喃,结构式为,:,8/2/20234花青素的结构特点现已查明,天然花色苷糖苷配,11/16/2024,5,花青素的稳定性影响因素,结构,C,3,羟基可使分子变得不稳定，,C,5,上有羟基或,C,4,发生取代都可使颜色趋于稳定,糖苷的形成也影响花色苷的稳定性,花色苷的酰基化显著增加其在微酸性至中性介质中的稳定性,8/2/20235花青素的稳定性影响因素结构,11/16/2024,6,温度,PH,醌型碱,黄烊盐,阳离子,假碱,查尔酮,8/2/20236温度醌型碱黄烊盐假碱查尔酮,11/16/2024,7,温度,当花色苷溶液加热时,平衡向着无色的查耳酮,(C),的方向进行,同时引起有色型化合物,(AH+A),的降低。当冷却和酸化时,醌型碱,(A),和假碱,(B),迅速变成阳离子,(AH+),。花色苷在温度小于,60,的条件下较为稳定，当温度大于,80,时，温度对花色苷有较明显的降解作用；,光对花色 苷的稳定性影响 很大,8/2/20237温度,11/16/2024,8,辅色剂的影响,花色苷同辅色剂联合形成一种垂直层叠的复合物,(Goto,等,1979),这种层叠过程产生一种疏水力,从而防止亲水核的加合作用和失色。,8/2/20238辅色剂的影响,11/16/2024,9,提取方法：一、萃取,溶剂法,常用的溶剂主要分为,3,类,:,水、亲水性有机溶剂和亲脂性有机溶剂。为防止花色苷的降解和提高花色苷的溶出率,常在溶剂中加少量的无机酸或有机酸，使提取液的,p H,控制在,3.15,以下。,8/2/20239提取方法：一、萃取溶剂法,11/16/2024,10,这是目前国内外广泛使用的提取方法，多数选择甲醇、乙醇、丙酮或它们的混合溶剂对材料中的花青素进行溶解过滤，通过酸或碱调节溶液酸碱度萃取滤液中的花青素。,该方法原理简单，对设备要求较低，不足之处是大多数有机溶剂毒副作用大且产物提取率低。,有机溶剂萃取法,8/2/202310这是目前国内外广泛使用的提取方法，多数选,11/16/2024,11,水溶液提取法,该方法一般在常压或高压下用热水浸泡含花青素的原材料，然后用非极性大孔树脂进行吸附；或直接使用脱氧热水提取，再采用超滤或反渗透经浓缩得到粗提物,陆国权等 研究表明，提取脚板薯花青素的最佳方法是：以,0,5,硫酸溶液作浸提剂，并使其,pH44,0,，在,6O,下加热,60 min,。,设备简单，无污染，产品无毒但纯度低。,8/2/202311水溶液提取法该方法一般在常压或高压下用热,11/16/2024,12,超临界流体萃取法,利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响进行提取。,最大的优点是产品提取率高，可以低温操作，避免了不饱和脂肪酸的氧化分解，溶剂无残留，且作为超临界流体的,CO,2,易得，萃取能耗低。,时海香等人研究了超临界CO,2,萃取常山胡柚天然色素的工艺,，,色素提取率可达,96.187,%,8/2/202312超临界流体萃取法利用压力和温度对超临界流,11/16/2024,13,提取方法：二、破除细胞壁,发酵提取法,原理是,:,通过微生物的作用使紫甘薯中的淀粉转化为乙醇,将乙醇分离后,可得到紫甘薯花色苷,原料的利用率大大提高。,其利用微生物破坏细胞壁和细胞膜,促进花色苷的溶出,提高提取率。通过发酵分解色素液中的糖、有机酸和其他杂质,大大降低了色素的纯化难度。,8/2/202313提取方法：二、破除细胞壁发酵提取法,11/16/2024,14,酶法提取,用于花色苷提取的酶主要有纤维素酶和果胶酶,通过酶解使植物细胞壁软化、膨胀及崩溃,从而促进了花色苷的溶出。,王萍等人通过单因素和正交试验,确定了黑加仑果渣花色苷酶法提取的的最佳工艺，黑加仑花色苷提取率的,91.109%,此法可以大大缩短花色苷提取时间,提高得率。,8/2/202314酶法提取用于花色苷提取的酶主要有纤维素酶,11/16/2024,15,辅助方法,超声波辅助提取,在超声波声场中,振动负压区由于周围的液体来不及补充,形成无数的微小真空泡,而当正压来到时,微小气泡在压力下突然闭合,液体间猛烈碰撞产生极大的冲击波,压力可高达,3 000 MPa,从而使植物细胞破裂,利于花色苷的溶出。,此法具有提取时间短,设备简单,操作方便等优点,并可有效防止热敏性成分的高温分解。,8/2/202315辅助方法超声波辅助提取,11/16/2024,16,微波辅助提取,当微波加热时,细胞内极性物质尤其是水分子吸收微波能,产生大量的热量使细胞内温度迅速上升,液态水汽化产生的巨大压力将细胞膜和细胞壁冲破,形成微小的孔洞,使胞外溶剂容易进入细胞内,溶解并释放出胞内物质。,与传统方法相比,微波法具有提取率高、时间短、能耗小等优点,因此微波用于天然素的提取工艺具有广阔的应用前景。,8/2/202316微波辅助提取当微波加热时,细胞内极性物质,11/16/2024,17,其他辅助方法,高压脉冲电场辅助提取,高压脉冲电场辅助提取法是一种新型非热技术,它具有提取温度低、速率快、时间短、提取率高、产品品质好的特点。,液态静高压法辅助提取,Corrales,等人用液态静高压辅助提取的方法从葡萄皮中提取花色苷,研究所得的最优工艺参数是,:100%,乙醇,温度,50,压力,600 MPa,。此法与未使用,HHP,法相比,产率提高,23%,。,H HP,具有提取温度低,时间短,不破坏色素结构等优点,但应用于花色苷等活性成分提取的报道还不多见。,8/2/202317其他辅助方法高压脉冲电场辅助提取,11/16/2024,18,提取条件比较,8/2/202318提取条件比较,11/16/2024,19,8/2/202319,11/16/2024,20,纯化,经过提取的花色苷粗品中往往含有很多有机酸、糖等杂质,产品质量稳定性差、纯度不高。为了提高产品的色价和稳定性,需要对提取物进一步纯化。,8/2/202320纯化 经过提取的花色苷粗品中往往含有,11/16/2024,21,柱层析法,凝胶柱层析,聚酰胺层析,硅胶层析,离子交换层析,8/2/202321柱层析法凝胶柱层析,11/16/2024,22,大孔树脂层析,大孔树脂是近代发展起来的一类有机高聚物吸附剂。分离工艺得到的提取物不吸潮，工艺简单，成本相对较低，树脂可反复使用适合工业化生产,杨迎花等 采用大孔树脂吸附纯化葡萄籽原花青素，结果表明大孔树脂吸附纯化工艺简单、成本低、产率高、安全适用。,8/2/202322大孔树脂层析大孔树脂是近代发展起来的一类,11/16/2024,23,膜分离法,花色苷提取中常用的膜分离技术有超滤,(UF),、反渗透,(RO),、电渗析,(ED),等。,Patil,用酸化的乙醇提取红萝卜花色苷,随后用膜分离的方法有效的脱醇并浓缩了花色苷提取液,使花色苷含量从,37216 mg/L,提高到,62518 mg/L,膜分离纯化的花色苷色价和透明度高,稳定性好,容易实现连续化生产,生产过程劳动强度低,流程简单,但对设备要求高,纯化成本高,提取效率低。,8/2/202323膜分离法花色苷提取中常用的膜分离技术有超,11/16/2024,24,鉴定,经过加工或储藏的材料会产生褐色降解物,这些降解物和花色苷具有相同的能量吸收范围,.,这类花色苷总量的测定,通常有两种方法,pH,示差法,差减法,8/2/202324鉴定经过加工或储藏的材料会产生褐色降解物,11/16/2024,25,鉴定方法,柱层析,薄层层析,光谱分析法,HPLC,、,MS,、,HPLC,MS,核磁共振法,毛细管区带电泳法,8/2/202325鉴定方法柱层析,11/16/2024,26,紫外可见光谱法,色素的紫外吸收光谱是色素的重要特征。吸收光谱是鉴定和测量混合物中主要色素的最简单方法。其主要原理是依据花色苷的不同基团的在不同的波长下有不同的吸收峰,进而推断出其结构。,B,环有邻位羟基的确定。糖基位置的确定。酰基是否存在的确定。甲基化与羟基化,8/2/202326紫外可见光谱法色素的紫外吸收光谱是色素,11/16/2024,27,HPLC,高效液相色谱法,(HPLC),以经典的色谱法为基础,引入了气相色谱法的理论和实验方法,流动相改为高压输送,采用高效固定相及在线检测手段发展而成的一种高效快速分离分析技术。,HPLC,可以在,30min,一个流程内分离,15,种不同的花色苷,其分辨能力远远超过纸层析和薄层层析。但是,由于缺乏花色苷的标准对照品,使得仅靠,HPLC,方法对花色苷进行定性和定量分析还不够充分。,8/2/202327HPLC高效液相色谱法(HPLC)以,11/16/2024,28,出峰顺序,9,种花色素苷的出峰顺序：花翠素,3,O,一葡萄糖苷、花青素,3-0,葡萄糖苷、,3,一甲花翠素,3,O,葡萄糖苷、甲基花青素,3,O,葡萄糖苷、二甲花翠素,3,O,葡萄糖苷、甲基花青素,3,O,一,(6,一,O,一乙酰,),葡萄糖苷、二甲花翠素,3,O,(6,O,乙酰,),葡萄糖苷、甲基花青素,3,O,(6,o-,对香豆酰,),葡萄糖苷、二甲花翠素,3,O,(6,0,对香豆酰,),葡萄糖苷,8/2/202328出峰顺序 9种花色素苷的出峰顺序：花,11/16/2024,29,双标样高效液相色谱法测定紫玉米花青素的含量,设备,Agilent 1 100,高效液相色谱仪和,Agilent Ion TrapXCT MS,：美国安捷伦公司；,Waters Xbridge C18(250 mmx4,6 mm,，,5 m),柱：美国,Waters,公司,色谱流动相：,A(5,甲酸,),，,B(,甲酸：水：乙腈,=5,：,45,：,50,，体积比,),；流速：,0.8mUmin;DAD,检测器；柱温,30,；梯度洗脱。,8/2/202329双标样高效液相色谱法测定紫玉米花青素的含,11/16/2024,30,标样,C3G,和,P3G,（,紫玉米花青素其主要以,C3G,和,P3G,及其衍生物为主要组成部分,）,结果,C3G,的加标回收率为,93.7%,（,RSD,为,0.804%,），可以确定以,C3G,为标样测定样品,C3G,含量更加准确。同理，样品中,P3G,及其衍生物以,P3G,为标样获得的结果更可靠。因此，使用双标样高效液相色谱法获得的紫玉米花青素含量（,93.77 mg/g,）更加准确。,P3G,：,芍药色素,-3-葡萄糖,C,G,：,矢车菊色素,-3-,葡萄糖苷,8/2/202330标样,11/16/2024,31,8/2/202331,11/16/2024,32,紫玉米花青素种类,近年来,采用温和的提取分离方法和现代分析仪器手段如,TLC,、,HPLC,、,MS,、,NMR,等,Aok i,等研究发现紫玉米籽粒中含有,8,种花青苷,:,矢车菊素,-3-,葡萄糖苷、天竺葵素,-3-,葡萄糖苷、芍药素,-3-,葡萄糖苷、两个