,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,免疫组织化学染色技术,免疫组织化学染色技术,组织化学染色技术,Histochemistry Technique,观察对象,组织、细胞,使用工具,普通显微镜,荧光显微镜,形态与结构,组织化学染色技术 Histochemistry Techni,免疫组织化学染色技术-课件,免疫组织化学染色技术,Immunohistochemistry Technique,指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原（目的蛋白）进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。,免疫组织化学染色技术 Immunohistochemistr,Immunohistochemistry Technique,特定蛋白（抗原）,Immunohistochemistry Technique,免疫组织化学染色技术-课件,授课提纲,基质标本的制作,荧光免疫组化技术,酶免疫组化技术,相关问题与解决方案,授课提纲 基质标本的制作,授课提纲,基质标本的制作,荧光免疫组化技术,酶免疫组化技术,相关问题与解决方案,授课提纲 基质标本的制作,标本类型,组织标本,冰冻切片,石蜡切片,细胞标本,体外培养细胞（单层细胞、悬浮细胞）,体液细胞（涂片）,标本类型 组织标本,固定与保存,固定的目的,防止细胞自溶，保持细胞形态与机构；,保存组织细胞抗原性；,防止标本脱落；,防止滋生微生物，预防组织腐败,标本固定以,不损伤细胞形态、不损伤抗原特异性,为基本原则,固定与保存 固定的目的,固定与保存,固定剂,蛋白类,乙醇或甲醇,微生物类,丙酮、三氯化碳,多糖类,10%,福尔马林,固定与保存 固定剂,抗原修复,目的：,充分暴露抗原表位，利于抗体识别。,方法：,酶（无花果蛋白酶，胰蛋白酶）消化法；,盐酸水解,微波处理,煮沸法,抗原修复 目的：,授课提纲,基质标本的制作,荧光免疫组化技术,酶免疫组化技术,相关问题与解决方案,授课提纲 基质标本的制作,标记物,荧光素,异硫氰酸荧光素（,FITC,）,四乙基罗丹明（,RB200,）,藻红蛋白（,PE,）,藻红蛋白花青苷（,PE-Cy5,）,标记物 荧光素,技术类型,直接染色法,荧光素直接标记在特异性抗体（,Ab1),间接染色法,荧光素直接标记在特异性抗体（,Ab2),第二抗体针对第一抗体种属特异性的表 位（如羊抗鼠,Ig,或羊抗人,Ig,）,技术类型 直接染色法,直接法,直接法,实例：细胞鉴定,免疫细胞及其亚群（流式细胞术）,T,细胞,CD3+,CD4+,CD8+,B,细胞,NK,细胞,实例：细胞鉴定 免疫细胞及其亚群（流式细胞术）,免疫细胞分类与计数,18,Suppressor T cell,R1,T cell/B cell,Helper T cell,免疫细胞分类与计数18Suppressor T cellR1,间接法,间接法,实例：检测抗核抗体,检测原理,已知抗原,肝细胞,/HEp-2,待检抗体,第二抗体,荧光标记兔抗人,Ig,实例：检测抗核抗体 检测原理,实例：检测病原体（病毒、细菌）,检测原理,待检病毒（抗原）,已知抗体,单抗或多抗,第二抗体,荧光标记羊抗鼠（或兔）,Ig,实例：检测病原体（病毒、细菌）检测原理,荧光显微镜（落射式）,关键,汞灯光源,激发滤片,暗场聚光镜,吸收滤片,荧光显微镜（落射式）关键,荧光显微镜（落射式）,荧光显微镜（落射式）,荧光显微镜（落射式）,荧光显微镜（落射式）,授课提纲,基质标本的制作,荧光免疫组化技术,酶免疫组化技术,相关问题与解决方案,授课提纲 基质标本的制作,主要类型,酶标记抗体,同荧光免疫组化,非酶标记抗体,酶,-,抗酶系统,生物素,-,链霉亲和素系统,主要类型 酶标记抗体,技术特点,以酶作为抗原，制备抗酶抗体；,酶（抗原）与抗酶（抗体）结合制备酶,-,抗酶复合物；,通过桥联抗体与识别系统（待检抗原,-,特异性抗体）连接；,技术特点以酶作为抗原，制备抗酶抗体；,酶桥法,酶桥法,常用酶和相应底物,过氧化物酶,Peroxidase,（,P,）,二氨基联苯胺（,DAB,）,碱性磷酸酶（,AP,）,alkaline phosphatase,（,AP,）,溴氯羟吲哚磷酸盐（,BCIP,）,常用酶和相应底物 过氧化物酶,过氧化物酶,-,抗过氧化物酶（,PAP,）法,P,AP,PAP,复合物,过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法PAPPAP复合物,抗体选择,第一抗体,识别抗原,第二抗体（桥联抗体）,能同时与第一、第三抗体结合,第三抗体,抗酶抗体,与第一抗体同源,抗体选择 第一抗体,P,P,P,A,A,A,图,双酶双底物,(,复合物法,),双重酶标染色原理,兔,PAP,GAR IgG,兔抗,Ag,鼠,APAAP,GAM.IgG,鼠抗,PPPAAA ,实例：淋巴瘤轻链双重染色法,一抗,兔抗,鼠抗,二抗,羊抗兔,羊抗鼠,显色系统,PAP,APAAP,实例：淋巴瘤轻链双重染色法 一抗 显色系统,亲和素,-,生物素,-,过氧化物酶复合体（,ABC,）,生物素（,Biotin,）,亲和素（,Avidin,）,生物素标记抗体（,B-Ab,）,生物素标记过氧化物酶（,B-P,）,亲和素-生物素-过氧化物酶复合体（ABC）生物素（Biot,亲和素,-,生物素,-,过氧化物酶复合体（,ABC,）,亲和素-生物素-过氧化物酶复合体（ABC）,EnVision,EnVision,授课提纲,基质标本的制作,荧光免疫组化技术,酶免疫组化技术,相关问题与解决方案,授课提纲 基质标本的制作,免疫组织化学染色技术-课件,识别抗体（第一）选择,单克隆抗体（,McAb,）,特异性强,敏感性差,多克隆抗体（,McAb,）,特异性差,敏感性强,识别抗体（第一）选择 单克隆抗体（McAb）,识别（第一）抗体选择,识别（第一）抗体选择,第二抗体选择,第二抗体选择,选择显色系统,荧光免疫组化,酶免疫组化,PAP,APAAP,ABC,LAB,？,选择显色系统 荧光免疫组化？,封闭非特异性结合,封闭非特异性结合,特异性显色,具备,特定部位显色,特定组织、特定细胞、特定结构,不均一显色,特异性显色 具备,非特异性显色,主要原因,内源性酶,内源性生物素,抗体特异性不强,漂洗不充分,基质制作,非特异性显色主要原因,非特异性背景显色,预先处理,加底物消耗,正常血清封闭,非特异性背景显色 预先处理,The End,The End,