单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,电离辐射的生物效应,1,概述,电离辐射将能量传递给有机体引起的任何改变，统称为电离辐射生物学效应（,ionizing radiation biological effect,），人类的放射损伤是一种严重的病理性辐射生物效应,。,2,电离辐射对机体的作用首先是辐射能量向细胞分子的传递，包括水分子和生物大分子。进而影响细胞、组织、器官乃至整个机体。,生物大分子主要涉及DNA、RNA和蛋白质，其中DNA的辐射效应尤为重要。,3,一、,小白鼠受,-射线后,LD,50/15,的测定,实验目的,1、观察不同剂量射线全身照射小白鼠后，在15天内死亡的百分率，测定小白鼠的,LD,50/15,。,2、掌握由外照射复制实验性急性放射病的一般方法及其照射动物的条件和程序。,4,实验原理,照射剂量与生物效应之间存在一定的相依关系。总的规律是剂量愈大，效应愈显著，但并不全呈直线关系。,电离辐射对多细胞机体特别是高等动物引起的死亡率变化的剂量效应关系呈一条S型曲线，曲线说明，当死亡率在50附近时，曲线有急剧的变化，即在此处剂量较小的变化就引起较明显死亡率改变。因此将引起被照机体死亡50时的剂量称为半致死剂量(LD50)，作为衡量机体放射敏感性的参数，LD50数值愈小，机体的放射敏感性愈高,5,一般以不同剂量的射线照射同种系、同性别、同年龄的小白鼠，使之产生急性放射损伤，以15天内小鼠的死亡率作为生物效应指标，得到,剂量死亡率曲线。,6,动物,健康雄性BALB/c小鼠，体重20克。,7,照射方法与步骤,1、取120只雄性小白鼠，随机分成10组，每组分别放入二个动物笼内饲养。,2、计算：距放射源等距离时，不同的照射剂量，所需的时间（或照射时间相同时，动物距放射源的距离。,8,3、在每组动物笼壁上标明照射剂量,，,60,Co,射线的照射剂量分别为,1.24、1.56、1.96、2.46、3.08、3.86、4.84、6.06、7.60、9.52Gy,。各组在照射时间一半时，调节动物笼保证全身均匀照射。照后，常规饲养。,4、照射后按规定时间记录。每天上午、下午、晚上各观察一次，记录小白鼠的死亡数，共观察15天。,9,实验结果,1、小白鼠LD50/15计算统计表,10,11,2、利用目测概率单位法和寇氏法求出小白鼠LD,50/15,，并绘制出小白鼠死亡率曲线。,12,目测概率单位法,(1)根据各组小白鼠死亡率，从百分率与概率单位对照表中查到各组死亡率的概率单位(死亡率0和100者不列入计算)。,(2)取方格坐标纸，横坐标表示剂量对数，纵坐标表示概率单位。,(3)沿着各点的分布趋势，用直尺绘制出一条适合各点的直线，力求直线通过各点中间。,(4)从概率单位5.0(死亡率50)通过所画直线处找出相对应的对数剂量。,（5）再对对数剂量取反对数即得出实际LD50/15的照射量,13,实习报告,根据小白鼠LD,50/15,计算统计表的数据，用目测法和寇氏法计算出小白鼠LD,50,，并绘制小白鼠死亡率曲线，以及求出小白鼠LD,50,的可信限。,14,分析讨论思考题,1、使用放射源照射动物应注意哪些事项？,2、怎样用随机方法对实验动物分组?,3、什么叫半数致死量（LD,50,），测定LD,50,有何意义?,15,二、电离辐射引起DNA链断裂的测定,实验原理,链断裂是电离辐射所致DNA损伤中常见的和重要的形式。电离辐射作用后引起DNA链断裂，产生片段化DNA。,16,许多荧光燃料可用来标记DNA，这些染料有：Hoechst、DAPI(46-diamidino-2-phenylindole，46-二脒基2-苯基吲哚)、溴化乙啶、吖啶橙等。,DAPI是DNA特异荧光染料，DAPI结合双链DNA的小沟，尤其是A-T碱基簇局部，为非嵌入方式，结合后，荧光增强约20倍。DAPI与DNA结合后以紫外激发，发射出明亮的蓝色荧光，用荧光分光光度仪测定出荧光强度。,17,关键技术,1、裂解液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA溶解。,2、已裂解的细胞液最好用硅化过的吸管吸取。硅化后玻璃不利于生物体如细胞、蛋白质、核酸的贴附。,3、各操作步骤要轻柔,尽量减少DNA的人为降解。,DNA的提取,18,4、取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰,5、提取DNA过程中所用到的试剂和器材要通过高压烤干等方法进行无核酸酶化处理。,6、所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。,19,试剂和主要仪器,一、试剂：,1、细胞裂解液1,10mmolL Tris，pH 7.4,lmmolL EDTA，pH7.5,0.5 TritonX-100,2、细胞裂解液II(用时新鲜配制),细胞裂解液中参加蛋白酶K 0.1mgml(终浓度),20,3、荧光缓冲液,10mmolL Tris，pH7.4,10mmolL EDTA，pH7.5,100mmolL NaCl,4、DAPI贮存液,1mg/L DAPI,注*：,DAPI可能是致癌剂。吸入、吞食或经皮肤吸收均有害。配制试剂时应戴手套，勿吸入粉尘。,21,5、0.01mol/L PBS,6、白细胞稀释液：2%冰醋酸,二、主要仪器,荧光分光光度仪,22,实验步骤,1、动物分组与照射,：,雄性健康昆明小鼠20只，体重20g左右。随机分为假照射对照组，1.0Gy，2.0Gy和4.0Gy射线全身照射组。,23,2、制备胸腺细胞单细胞悬液,照射后12h，采用颈椎脱臼法处死小鼠，取仰卧位，剪开胸前皮肤和肌肉，用镊子别离并迅速取出胸腺，剔除周围结缔组织（注意观察比较照射组小鼠与假照组小鼠胸腺的差异），放入平皿中，用小试管或毛玻片轻轻研磨。制备单细胞悬液，调节细胞浓度为1107细胞/ml。,24,3、DNA的提取与别离,510,6,个细胞,0.01mol/L PBS洗二次1500rpm、5min,加细胞裂解液I 100ul,4C，30min（冰箱）,1600rpm离心，20min,510,6,个细胞,0.01mol/L PBS洗二次1500rpm、5min,加细胞裂解液I 100ul,4C，30min（冰箱）,1600rpm离心，20min,25,上清（片段化DNA）沉淀,加细胞裂解I 100ul,1600rpm离心，20min,混合 200ul,上清（片段化DNA）完整DNA,上清,上清（片段DNA）,沉淀（完整DNA）,加细胞裂解液II 200ul,片段化DNA,26,4、,DNA,荧光检测,取3ml荧光缓冲液，加DAPI（0.1mg/ml）60ul，参加DNA样品（上清或沉淀）10ul，用荧光分光光度计仪测定荧光强度。激光波长355nm，发射波长455nm。,27,5、,DNA,裂解率的计算,28,分析讨论思考题,1、电离辐射所致DNA链断裂的形式及其分子机制？,2、除荧光分光光度仪，还可用什么仪器检测DNA，设计一具体的实验方案，测定不同剂量照射时DNA的断裂率。,3、DNA损伤的生物学意义？,29,三、,小鼠骨髓造血干细胞剂量存活曲线的测定,细胞剂量存活曲线描述辐射剂量与细胞存活分数之间的关系。对于有完整增殖能力的细胞，如骨髓造血干细胞或离体培养生长的细胞等，凡保存其增殖能力能持续繁殖产生克隆或集落，称之为存活细胞。在体内或离体培养条件下，一个存活细胞繁殖成的一个细胞群体，称之为一个细胞集落(Colony)。这些细胞一旦丧失完整的增殖能力，即发生增殖死亡。,实验原理,30,通过体内或体外测量技术可测定不同剂量照射后细胞的集落数，计算出各剂量点细胞的存活分数(Surviving fraction)，并绘制出该细胞的剂量存活曲线，求出相应的参数(如D37值或D0值等)，以比较细胞的放射敏感性。,31,本实验采用细胞存活的体内测量技术，测定骨髓多能造血干细胞的剂量存活曲线。其原理是：将受不同剂量照射小鼠(称之为供体)的骨髓细胞移植到受致死剂量照射的同系小鼠(称之为受体)体内。供体造血干细胞可在受体脾脏增殖形成集落，称之为,脾集落或脾结节。,因此时受致死剂量照射的受体小鼠体内已无内源性造血干细胞存在，故移植后在受体小鼠脾脏形成的脾结节则全部来自供体。,32,通过实验可测定出不同剂量照射后的脾结节数，计算出存活分数，并绘制出骨髓多能造血干细胞的剂量存活曲线。,33,主要试剂和器材,1640培养液,白细胞稀释液,75酒精,Bouins液(苦昧酸-甲醛固定液),超净工作台,光学显微镜,34,实验步骤,1、骨髓细胞悬液制备(供体),1）杀鼠取股骨（无菌操作）：,受不同剂量照射的供体小鼠，于照后24h颈椎脱臼处死，无菌条件下取出一侧股骨，用无菌纱布除掉附着的肌肉。,35,2）制备骨髓单细胞悬液,剪去股骨上端，用装有6号针头的注射器（事先用1640培养液冲洗）由骰骨下端刺入，将骨髓腔内的全部骨髓细胞冲入盛有10ml培养液的广口瓶中(反复冲3次)。然后，换4号针头吹打细胞，制备单细胞悬液。按白细胞计数法计数有核细胞数，调细胞浓度为510,5,个ml。置广口瓶于冰上，保存细胞备用,。,36,2、受体小鼠的准备及骨髓细胞输注,1)受体照射：,受体小鼠接受8.5Gy射线全身照射，照后24h进行骨髓细胞输注。,2)骨髓细胞输注：,将备用供体骨髓细胞悬液充分混匀后，吸入装有4号针头的lml注射器中，经尾静脉输注入受体中。每只鼠输入0.2ml悬液，含骨髓细胞10,5,个。,37,3、脾结节计数,骨髓细胞输注后9天，杀鼠取脾脏，置入Bouins液中固定12h后，解剖显微镜下或用放大镜计数脾结节数。,38,实验结果,1、,实验结果记录于附表中。,2、绘制剂量存活曲线。,39,40,分析讨论思考题,1、简述实验原理,2、脾结节形成的意义及与照射剂量之间的关系。,41,