单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,流式细胞术,-,理论及应用,主要内容,流式细胞术简介,流式细胞术应用,细胞周期检测,细胞凋亡检测,流式细胞仪预约使用规范,附二院分析型流式细胞仪,BD Canto II,二激光六色,(,自动上样，同时容纳,40,个样本,),488nm,蓝激光,633nm,红激光,Beckmen,Cytoflex,双激光六色（单上样管，半自动上样）,488nm,蓝激光,635nm,红激光,流式细胞仪基本构造,液流系统,流动室,液流驱动系统,光学系统,激发光源,光束收集系统,电子系统,光电转换器,数据处理系统,荧光信号,电信号,数字信号,流式细胞术,:,用于对,悬浮,于流体中的微小颗粒进行计数和分选。这种技术可以用来对流过光学或,电子,检测器的一个个细胞进行连续的,多种参数,分析。,流式细胞术（,Flow,Cytometry,FCM,）,进样孔,光信号,激光束,鞘液,Sheath,流式细胞术光信号类型,散射光信号,：与标记荧光素无关，是细胞的固有参数。,前向散射光,(forward scatter,FSC);,侧向散射光,(side scatter,SSC),荧光信号,自发荧光,：微弱,特异荧光,：标记的荧光素分子发出的荧光，比自发荧光强很多倍。,散射光信号,FSC,和,SSC,当颗粒通过聚焦光束时，激光向各个方向散射。与激光束方向同轴的称前向角散射光信号（,FSC,）。与激光束垂直的称侧向角散射光信号（,SSC,）。,FSC,：反应细胞大小和活力,SSC,：反应细胞内部颗粒度和精细结构变化,FSC/SSC,的作用,实验中，常利用,FSC,和,SSC,这两种参数的组合，区分不同的细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。,荧光信号,当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过激光束时，燃料吸收光子跃迁到高能级，返回基态时，染料释放出能量，以光的形式释放。这种发出的光成为荧光。,荧光通道,散射光通道,:FSC,和,SSC,通道；,荧光通道,通道命名方式：,以,FL(fluorescence,),加数字命名，如,FL1,、,FL2,、,FL3,等。,以该通道接收的主要荧光素命名，如,FITC,通道、,PE,通道、,APC,通道等。,FL,的作用,荧光素分子,激发光波长,（,nm,）,发射光波长,（,nm,）,中文名,FITC,490,520,异硫氰酸荧光素,PE,488,575,藻红蛋白,PerCP,490,675,多甲藻叶绿素蛋白,APC,650,660,别藻青蛋白,PE-Cy5,496/546,670,藻红蛋白,-,花青素,5,PE-Cy7,496/546,767,藻红蛋白,-,花青素,7,Alexa,Flour 488,495,519,Alexa,Flour 647,650,665,常用荧光染料,499nm,蓝色荧光（,Blue,）,；,500-549nm,，绿色荧光（,Green,）,；,550-584nm,，黄色荧光（,Yellow,）,585-615nm,，橙色荧光（,Orange,）,；,616-700nm,，红色荧光（,Red,）,；,700nm,，远红外荧光（,Far-Red,）,。,荧光抗体的选择,根据流式细胞仪选择抗体,根据抗原表达强弱合理选择抗体,不同荧光素强度有所不同,高表达的抗原可不用太,“,亮,”,的荧光染料，,“,亮,”,的荧光染料分配给表达低的抗原,选择荧光波谱见光谱重叠小的染料进行组合，同时正确的调节补偿,(,细胞携带两种以上荧光素激发出不同波长荧光时，理论上可选择滤光片使每种荧光仅被相应的通道检测。由于目前使用的各种荧光染料都是,宽发射谱,性质，因而少量的荧光信号会被另一通道检测到，这种现象就是,光谱重叠,.,),对照的设置,空白对照,设置空白对照（未染色的细胞），用以区分细胞的自发荧光和特异性荧光，避免假阳性的结果。,流式结果中荧光强弱是一个相对值，光电倍增管电压越信号越强。通过调节电压，使阴性对照管的荧光强度处于阴性的位置，实验组的荧光值都是相对对照组。,同型对照,非特异性染色,抗体的,Fc,段可以与细胞表面的,Fc,受体非特异性结合；,抗体进入胞内，不容易洗脱，造成非特异性染色。,实验抗体：,FITC-CD3,单克隆抗体为鼠,IgG1,亚型抗体,;,同型对照：相同剂量未免疫小鼠血清纯化的,IgG1,，并标记,FITC,。,单标对照,两色或多色实验时须设置单标对照，用于补偿的调节,(,以,PE/FITC,为例,),；,单标实验时不需要。,FL-1(FITC),FL-2(PE),FL-1(FITC),FL-2(PE),FL2-%FL1,FL-1(FITC),FL-2(-),FL-1(-),FL-2(PE),FL1-%FL2,补偿前,补偿后,FITC,单标,PE,单标,流式数据显示,:,单参数直方图,(Histogram),双参数数据显示,-,散点图,(Dot Plot),-,等高线图,(Contour Plot),-,密度图（,Density Plot,）,三维图,(3D Plot),直方图,(Histogram):,横坐标是散射光或荧光相对强弱，纵坐标代表细胞数,散点图：,每一个点代表一个细胞，横纵轴各代表一个参数,等高线图：,同一条线上的细胞数目相等，越靠里的曲线说明细胞数目越多,密度图：点密度越大的地方，细胞数越多,三维图,FSC/SSC/FL,荧光抗体选择原则,对照设置（荧光补偿）,流式数据显示,小结,流式细胞术应用,-,细胞周期,细胞周期：,细胞从一次分裂完成到下一次细胞分裂结束所经历的全过程，分为间期和分裂期两个阶段,周期检测的原理,周期检测步骤,0.25%,胰酶（无,EDTA,）消化，将细胞消化成单个。,离心收集细胞，弃上清，用预冷,PBS,洗细胞两次。,打孔：加入,1ml,预冷（,-20,度）,70%,乙醇,到细胞沉淀中，于,4,度固定过夜（或实验周期长可以,-20,长期固定）。,离心收集细胞，以,1mL,的,PBS,洗细胞两次，加入,500uLPBS,含,50ug/mL,溴化乙锭（,PI,），,100ug/mL RNase A,，,4,避光孵育,30,分钟，上机检测。,样本来源,培养的细胞、血液、骨髓、体液、组织等的单细胞都可用于,DNA,分析；标本数应大于,10,6,注意,获得,单个细胞,，尽量避免,DNA,降解；,样本关键,减少碎片,（无,EDTA/,不可过度吹打,/,离心）；,PI,既能和,DNA,结合，又能跟,RNA,结合，所以要用,RNase,降解,脱氧核糖核酸酶会降解,DNA,故耗材试剂要干净灭菌。,流式细胞术应用,-,细胞凋亡,细胞凋亡概念,为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。是机体,主动,、高度,有序,清除无用细胞的过程。是生物体中一种普遍存在的现象。区别于细胞坏死（外力引起的细胞无序变化的死亡过程）,细胞凋亡多事件发生,早期：,AnnexinV,（,PS,外翻）,早中期：,JC-1,(,线粒体膜电位,),中晚期：,caspase-3,、,8,、,9,（,western,）,晚期：,TUNEL,（,DNA,片段）,不同时期凋亡检测指标,早期凋亡特征：,磷脂膜（,PS,）外翻,，但是,细胞膜,保持,完整性,，因此,PI,染色为阴性,DNA,没有发生断裂,AnnexinV,（磷脂结合蛋白）,对照设置：,空白对照：不加,AnnexinV/PI,用以调节电压，阴阳性细胞界限,单阳对照：诱导凋亡，,AnnexinV/PI,单染，用来补偿,双染阴性对照：未诱导的,AnnexinV+PI,双染。用它确定两荧光通道电压，排除非特异性结合,注意：,细胞制备或存储时细胞膜损伤，造成假阳性,贴壁细胞消化时避免使用,EDTA,，螯合钙离子,当样本表达,GFP,时，禁用,AnnexinV-FITC,推荐使用,AnnexinV-,APC,/7-AAD,染色,JC-1(BIC2),检测线粒体膜电位变化,原理：,JC-1,有单体跟多聚体两种形式。浓度高时，,JC-1,呈多聚体，可以产生红色荧光；在浓度较低时，,JC-1,为单体，可以产生绿色荧光。,正常细胞,：膜电位正常，,JC-1,随线粒体膜极性进入线粒体，随浓度升高而成多聚体，发红色荧光。,凋亡细胞,：线粒体膜去极化，,JC-1,从线粒体释放，浓度降低，转为单体，发绿色荧光。通过检测红绿两种荧光区分。,Caspase-3,检测,-,细胞凋亡过程中，胞内主要蛋白通常被降解，调节这一过程的蛋白叫做,Caspase,（半胱氨酸,-,天冬氨酸蛋白酶,),。,Caspase 3,是参与,DNA,维护和调控细胞的重要组分，即,Caspase 3,激活,=,细胞凋亡,TUNEL,检测,凋亡晚期特征,DNA,内切酶活性激活升高，双链,DNA,切断形成,185bp,的有序片段。,Tunel,流式法,:,基因组,DNA,断裂时，暴露的,3,-OH,可以在末端脱氧核苷酸转移酶,(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT),的催化下加上荧光素,(FITC),标记的,dUTP(fluorescein-dUTP),，通过流式细胞仪进行检测。,一步法,FITC-dUTP,染色凋亡细胞,流式细胞仪,488nm,激发，,PI,发出,623nm,荧光，,FITC,发出,520nm,荧光,两步法,PI,染总,DNA(,周期,),FITC-dUTP,染色凋亡细胞（如不需要周期信息，可不做,PI,染色）,TUNEL,检测,TUNEL,检测,小结：细胞凋亡,-,流式分析,活细胞,细胞凋亡流式分析,固定细胞,膜不对称性改变,AnnexinV,线粒体膜电位变化,Mitoscreen(JC-1),TUNEL/DNA,片段化,流式的其他应用,黏附因子,表面受体,细胞因子,分泌到胞外的细胞因子,胞内抗原,核酸含量,核内抗原,流式细胞仪预约使用规范,CytoFlex,预约使用规范,每,周一、三、五（,10:00-16:30,）,为流式预约使用时间段,需要使用流式的同学请,至少提前一天,预约,预约成功后，必须,准时上机,检测,临时有事不能进行实验的同学，请至少于检测前一小时告知,实验结束后，及时带走检测完的样本，并登记检测时间,数据拷取必须使用实验室配备,专门,U,盘,。,谢谢！,