,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量,环境学院,汪松美,考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量环境学院,1,实验类型,基础验证型,实验目的,掌握和学习考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量的基本方法,实验类型基础验证型实验目的,2,一 原理,考马斯亮蓝G-250染料,酸性溶液中,与蛋白质疏水区结合,465nm,棕红色,青蓝色,595nm,一 原理考马斯亮蓝G-250染料酸性溶液中与蛋白质疏水区结合,3,在一定蛋白质浓度范围内(1-1000ug)，蛋白质和色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质浓度成正比，故可用于蛋白质的定量测定,在一定蛋白质浓度范围内(1-1000ug)，,4,简便快捷，灵敏度高，稳定性好,考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量ppt课件,5,二 试剂、材料与设备,2.1主要试剂,1 标准蛋白质溶液的配制,：,牛血清白蛋白(BSA),10mg,定溶于100ml 0.9%NaCl溶液,100g/ml的标准蛋白质溶液,二 试剂、材料与设备牛血清白蛋白(BSA)10mg定溶于10,6,2 考马斯亮蓝G-250试剂的配制,：,考马斯亮蓝G-250,溶于50ml,加100ml,蒸馏水定容至1L,100mg,95%乙醇,85%的磷酸,2 考马斯亮蓝G-250试剂的配制：考马斯亮蓝G-250溶于,7,3 样品液的准备,：,牛血清白蛋白标准溶液(0.1mg/ml),稀释至一定浓度的样品液,用0.9%NaCl溶液,3 样品液的准备：牛血清白蛋白标准溶液(0.1mg/ml)稀,8,2.3 主要仪器,722分光光度计,漩涡混合器,移液器,移液管,烧杯,吸耳球,擦镜纸,试管,2.3 主要仪器722分光光度计漩涡混合器移液器移液管烧杯吸,9,三 实验方法,3.1 标准曲线的绘制,取6支试管按下表操作，摇匀，2-5min后在595nm下比色，1号管为对照管，作吸光度-蛋白浓度曲线,管号,1,2,3,4,5,6,100g/ml标准蛋白质(mL),0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,0.9%NaCl溶液(mL),1.0,0.8,0.6,0.4,0.2,0,考马斯亮蓝G-250染料(ml),4,三 实验方法管号1 23 45 6100g/ml标准蛋白,10,3.2 样液的测定,干,净,试,管,1ml样品液,4ml染液,混匀,静置3min,595nm,读取吸光度，反查标准曲线,3.2 样液的测定干1ml样品液4ml染液混匀静置3mi,11,四 注意事项,移液管的正确使用,分光光度计的正确使用,移液枪,的正确使用,四 注意事项移液管的正确使用,12,五 思考,1）考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理是什么？,2）测定蛋白质含量还有哪些方法，测定原理有哪些不同？,五 思考1）考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理是什,13,量程的调节,枪头（吸液嘴）的装配,移液的方法,移液器的正确放置,维护保养时的注意事项,移液枪的使用方法,量程的调节移液枪的使用方法,14,移液枪的结构,吊钩,手柄,枪杆,移液控制及调节旋纽,吸/枪头,推出器,数字显示器,移液枪的结构吊钩手柄枪杆移液控制及调节旋纽吸/枪头推出器数字,15,1.量程的调节,！,看清量程再调节,左手握枪柄，,右手顺时针(调小)或逆时针(调大)旋动,千万不要将按钮旋出量程，,否则会卡住内部机械装置而损坏了移液枪。,1.量程的调节！看清量程再调节左手握枪柄，千万不要将按钮旋,16,2.枪头（吸液嘴）的装配,将移液枪（器）,垂直,插入枪头中，,稍微用力,左右微微转动即可使其紧密结合。,切忌,使劲地在枪头盒子上敲几下。,退出枪头时，,只需按一下枪头推出器即可。,2.枪头（吸液嘴）的装配将移液枪（器）垂直插入枪头中，稍微用,17,3.移液的方法,注意：,吸取液体时，移液器保持,竖直,状态，将枪头插入,液面下2-3毫米,。切勿将整个枪头浸于液体中,！,在吸液之前，可以先吸放几次液体以润湿吸液嘴（尤其是要吸取粘稠或密度与水不同的液体时）。,3.移液的方法注意：在吸液之前，可以先吸放几次液体以润湿吸液,18,前进移液法,(常用),1.按钮按下至第一停点(AB),2.慢慢松开按钮回原点(A),3.按钮按至第一停点(B)排出液体,稍停片刻,4.按按钮至第二停点(C)吹出残余的液体,松开按钮,前进移液法示意图,前进移液法(常用)1.按钮按下至第一停点(AB)2.慢慢,19,(2),反向移液法,一般用于转移高粘液体、生物活性液体、易起泡液体或极微量的液体。,原理就是先吸入多于设置量程的液体，转移液体的时候不用吹出残余的液体。,1.按下按钮至第二停点(C),2.慢慢松开按钮至原点(A),3.按钮按至第一停点(B),排出设置好量程的液体,4.保持按住按钮位于第一停点（千万别再往下按），打出即为所需液体,取下有残留液体的枪头，弃之,(2)反向移液法 一般用于转移高粘液体、生物活性,20,4.移液器的正确放置,使用完毕，可以将其竖直挂在移液枪架上，但要小心别掉下来。,当移液器枪头里,有液体时,，,切勿,将移液器,水平放置或倒置,，以免液体倒流腐蚀活塞弹簧。,4.移液器的正确放置 使用完毕，可以将其竖,21,5.维护保养时的注意事项,如不使用，要把移液枪的量程调至最大值的刻度，使弹簧处于松弛状态以保护弹簧。,最好定期清洗移液枪，可以用肥皂水或60 的异丙醇，再用蒸馏水清洗，自然晾干。,高温消毒之前，要确保移液器能适应高温。,5.维护保养时的注意事项,22,考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量ppt课件,23,考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量ppt课件,24,722 型分光光度计的使用及注意事项,1、插上插头，接通电源，打开暗箱盖，预热20min。,先在暗箱盖开启状态下调节零点调节器，使读数盘指针指向t=0处。然后盖上暗箱盖，调节“100”调节器，使空白管的t=100，,注意：,分光光度计在接通电源而不用时，必须打开暗箱盖，以免光电管老化。,暗箱,722 型分光光度计的使用及注意事项1、插上插头，接通电源，,25,2、将选择选扭由“T”调至“A”，此时读数应由“100”至“0”，若不为“0”，可用“消光零”旋钮调节,2、将选择选扭由“T”调至“A”，此时读数应由“100”至,26,3、将准备好的试剂倒入比色杯中，用吸水纸擦去比色杯外侧水珠，并依次放入比色杯架中。,注意：,手拿比色杯毛面，试剂倒入杯中满2/3 即可。,3、将准备好的试剂倒入比色杯中，用吸水纸擦去比色杯外侧水珠，,27,Thank you!,Thank you!,28,