单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,2024/11/15,1,参考标准,中华人民共和国药典,2005,版 附录 微生物限度检查法,ISO 11737-1:2006 Sterilization of medical devices,Microbiological methods,Part 1:Determination of a population of microorganisms on products,GB/T 19973.1/ISO 11737-1:1995,医疗器械的灭菌 微生物方法 第一部分：产品上微生物总数的估计,GB 15980-1995,一次性使用医疗用品卫生标准,2024/11/15,2,检测环境及检验量,应在环境洁净度,10000,级下的局部洁净度,100,级的单向空气区域内进行,一般供试品的检验量为,310,个独立包装的同批次供试品。（见,ISO 11737-1:2006 A8.1,）,2024/11/15,3,实验材料及设备,营养琼脂培养基、,pH7.0,氯化钠,-,蛋白胨缓冲液,滤器、微孔滤膜（孔径,0.45,微米，直径,50mm,）、量筒、剪刀、镊子、培养皿,过滤装置、电子天平、压力蒸汽灭菌器、生化培养箱等,2024/11/15,4,主要步骤,采样,供试液制备,培养,菌落计数,2024/11/15,5,供试液的制备,用？,ml,氯化钠,-,蛋白胨缓冲液浸提？小时（包括最内层包装的内壁）,-,所需供试液的用量和浸提时间需验证,处理方法：振动、冲洗、擦拭法、袋蠕动、超声、涡旋混合、搅拌,2024/11/15,6,举例,振动,小型医疗器械可以投入无菌的自封袋中，加入缓冲液充分振动。,另外，用缓冲液冲洗内包装袋的内壁。并与产品缓冲液相混。,2024/11/15,7,梯度稀释,1ml,1ml,1ml,1ml,1ml,1ml,1ml,1ml,供试液,9mlNacl,9mlNacl,1:10,1:100,1:1000,2024/11/15,8,转至培养基,膜过滤法,适用于微生物浓度较低的悬液,平板倾注,适用于微生物浓度较高的悬液,平板涂布,适用于微生物浓度较高的悬液,螺旋涂布,2024/11/15,9,薄膜过滤法,2024/11/15,10,培养,药典中的培养条件：,细菌,30-35 48h,霉菌、酵母菌,23-28 72h,必要时，可适当延长培养时间至,5-7,天,2024/11/15,11,菌落计数,计数方法：,将平板置菌落计数器或从平板的背面直接以肉眼用标记笔点计，以投射光衬以暗色背景，仔细观察，计数。必要时可以借助于放大镜、菌落计数器。,菌落特征：,形态特征：常为白色、灰白色或灰色，亦有淡褐色、淡黄色（如果培养基中加入,0.1%TTC,(,氯化三苯基四氮唑试剂,),，,菌落为红色）,边缘整齐或不整齐，表面有光滑、粗糙，皱褶、突起或扁平。,大小差异很大。,2024/11/15,12,计数方法的验证,回收率,验证试验至少应进行,3,次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。,A,试验组 供试液,+,试验菌（,50100cfu,）,B,菌液组 试验菌（,50100cfu,）,C,供试品对照组,D,缓冲液对照组 缓冲液,+,试验菌（,50100cfu,）,(A-C)/B70%,D/B70%,2024/11/15,13,菌落计数报告规则,平板法,选取细菌、酵母菌平均菌落数在,30,300,之间、霉菌平均菌落数在,30100,之间的稀释级作为报告菌落数的依据。,1,）如只有,1,个稀释级平均菌落数符合上述规定，则将稀释级的菌落数乘以稀 释倍数报告。,2,）如有两个相邻稀释级的平均菌落数在,30,300,之间，则先计算两稀释级菌落数的比值。,高稀释级的平均平板菌落数,稀释倍数,比值,=,低稀释级的平均平板菌落数,稀释倍数,当比值,2,时，则以,2,个稀释级的平均菌落数均值报告；当比值,2,但不超过,5,时，则以低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数报告；当比值大于,5,，或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再进行检查，必要时，应进行方法的重新验证。,3,）如各稀释级平均菌落数均在,300,以上，则按最高平均菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释级平均菌落数均在,30,以下，则按最低平均菌落数乘以稀释倍数报告。,4,）如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于,1,时，以,1,乘以最低稀释倍数的值报告菌数,