单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,临床检验中的发光免疫分析,原理、优势和值得注意的问题,北京大学医学部研究员,中国生物物理学会光生物学专业委员会副主任委员,国际生物发光和化学发光学会(ISBC）学术理事,Council member of scientific advisory board of,International Society on Bioluminescence&Chemiluminescence,杨晓林,临床检验中的发光免疫分析原理、优势和值得注意的问题北京大学,1,由于化学反应（通常是氧化）或生物化学反应产生电子能级处于激发态的物质，后者通过跃迁释放能量并产生光子，从而导致的发光现象。,与荧光最大的区别在于无需激发光,，因此后者也被称为光致发光。,发光（Luminescence）,化学发光（Chemiluminescence）生物发光（Bioluminescence）,生物发光和化学发光均属于,冷光,，即发光不是由于发光体温度升高所致，因此其,反应能量绝大部分用于发光,而不是发热，发射波长也与温度无关。,发光测定属发射光谱分析，多采用动力/速率法或积分法，,无需终止反应，也不,受,朗伯-比尔定律限制,；,而酶标显色测定属吸收光谱分析，多采用终点法，,需终止反应，并受,朗伯-比尔定律限制,。,由于化学反应（通常是氧化）或生物化学反应产生电子能级处于激发,2,按化学反应类型,化学发光的分类,酶促化学发光：,辣根过氧化物酶系统,碱性磷酸酶系统,黄嘌呤氧化酶系统,非酶促化学发光：,吖啶酯系统,草酸酯系统,三价铁-鲁米诺系统,闪光（Flash）:,按发光持续时间,发光时间在数十分钟以上，如：,HRP-Luminol系统,AP-AMPPD系统,黄嘌呤氧化酶系统,无须原位进样、以速率法测量。,发光时间在数秒内，如吖啶酯,以原位进样(In Situ Injector)和时间积分法测量,辉光（Glow）:,按化学反应类型,3,时间,发光信号,辉光坪区,速率法测量,原位进样,积分法测量,闪光尖峰,闪光与辉光及其测量方式的差别,时间发光信号辉光坪区速率法测量原位进样积分法测量闪光尖峰闪光,4,鲁米诺及其衍生物的增敏化学发光系统,H,2,O,2,+,NH,2,O,O,NH,NH,N,2,OH,-,HRP,NH,2,CO,2,-,CO,2,-,+Photon(425nm),R,OH,R,OH,N,S,R,B,OH,OH,增强剂,（Enhancer）,商业化产品中常见的化学发光系统（一）,鲁米诺及其衍生物的增敏化学发光系统H2O2+NH2OONH,5,AMPPD及其衍生物的化学发光系统,+,*,光子(477nm),AP,O,O,OCH,3,OPO,3,2-,O,-,O,O,OCH,3,O,O,-,O,OCH,3,商业化产品中常见的化学发光系统（二）,AMPPD及其衍生物的化学发光系统+*光子(477nm)AP,6,CH,3,C=O,O,R,N,+,OH,-,H,+,H,2,O,2,+H,2,O,+,R,OH,光子+CO,2,+,CH,3,C=O,O,R,N,HO,CH,3,C=O,O,R,N,HOO,CH,3,O,N,CH,3,O,N,C=O,O,商业化产品中常见的化学发光系统（三）,吖啶酯化学发光系统,CH3C=OORN+OH-H+H2O2+H2O+ROH光,7,发光检测的剂量-反应关系曲线,信号强度（Y）,实际曲线,标记物浓度（X）,理论/校正曲线,由于：不同发光体系和免疫分析模式具有不同的实际信号曲线,因此：科学准确的特定校正技术是衡量设备和试剂匹配性的关键,发光检测的剂量-反应关系曲线信号强度（Y）实际曲线标记物浓,8,发光信号检测,光敏二极管、光敏电池、光电偶合器（CCD）,结构简单、性能稳定,但灵敏度低、线性范围较窄。,主要特点,原理：,光信号,光电转换器件,电压或电流信号,放大,发光信号检测光敏二极管、光敏电池、光电偶合器（CCD）结构简,9,单光子计数器是目前高灵敏度,发光分析仪的核心部件,光电倍增管,高压,高速放大器,高速比较器,高速分频器,发光样品,产生光子,激发光阴极,产生光电子,在阳极上形成较强信号,脉冲信号,相对发光单位,数字脉冲(RLU),在各打拿极之间得到,能量和数目的倍增,单光子计数器是目前高灵敏度光电倍增管高压高速放大器高速比较器,10,单光子计数器的工作特性,光子计数（Y）,发光强度（X）,饱和点,理论/校正曲线,实际计数曲线,由于：单光子计数是在检测随机光子事件,因此：随光子数量增多检测效率持续下降,所以：准确的校正技术是设备品质的关键,模拟（光电流）测量曲线,单光子计数器的工作特性光子计数（Y）发光强度（X）饱和点理论,11,单光子计数式发光检测仪,计,算,机,打,印,机,发光仪控制模块,发光仪执行模块,控制器,程控高压,计数/贮存器,单光子计数器,样品运动/定位装置,程控自动门锁及检测装置,原位注射泵,单光子计数式发光检测仪计打发光仪控制模块发光仪执行模块控制器,12,光生物学技术的应用范围,军事侦测,公安稽查,卫生检疫,药物筛查,医学诊断,环境检测,航天遥感,生命科学,已成为现代生物技术最活跃的领域之一,光生物学技术的应用范围军事侦测 已成为现代生物技,13,光生物学检测技术的优越性,彻底消除了放射性危害,无半衰期限制，试剂稳定性和有效期大大延长,容易实现连续、动态、重复测定,适合于复合标记系统进行多指标并行测定,操作简单，反应速度快，容易实现自动化,灵敏度和线性范围超过以往技术,光生物学检测技术的优越性彻底消除了放射性危害适合于复合标记系,14,几种标记/检测技术理论极限灵敏度的比较,酶标,荧光,放免,发光,灵敏度(mol/L),10,-18,10,-15,10,-12,10,-9,几种标记/检测技术理论极限灵敏度的比较酶标荧光放免发光灵敏度,15,几种标记/检测技术理论线性范围的比较,酶标,荧光,放免,发光,线性范围,10,5,10,4,10,3,10,2,几种标记/检测技术理论线性范围的比较酶标荧光放免发光线性范围,16,几种标记/检测试剂的有效期比较,酶标,荧光,放免,发光,有效期（月）,18,15,12,9,6,3,0,几种标记/检测试剂的有效期比较酶标荧光放免发光有效期（月）1,17,0,20,000,40,000,60,000,80,000,100,000,试剂盒,仪器,特殊防护,治理污染,人民币,人民币,三种免疫测定技术的成本及费用,三种免疫测定技术的成本及费用,放免,酶标,发光,020,00040,00060,00080,000100,0,18,夹心法的剂量-反应关系曲线,信号强度（Y）,线性范围,待测物浓度（X）,Hook(前滞,)效应,分析灵敏度（最低检测限）（95%可信度）：,S0,+,2SD在该曲线上所对应的浓度值。,功能灵敏度：,测定误差（变异）20%的最低可检测浓度。,线性范围：,（分析）,功能灵敏度-变异20%的最高检测浓度,相关系数0.99的曲线范围,夹心法的剂量-反应关系曲线信号强度（Y）线性范围待测物浓度,19,竞争法的剂量-反应关系曲线,待测物浓度（X）,信号强度（Y）,线性范围,分析灵敏度（最低检测限）（95%可信度）：,S0-2SD在该曲线上所对应的浓度值,功能灵敏度：,测定误差（变异）20%的最低可检测浓度,线性范围：,（分析）,功能灵敏度-变异20%的最高检测浓度,相关系数0.99的曲线范围,竞争法的剂量-反应关系曲线待测物浓度（X）信号强度（,20,发光免疫分析技术,的现状及应注意的问题,发光免疫分析技术,21,商品化光生物学标记检测技术性能比较,技术类型,标记、反应体系,主要优点,主要不足,化,学,发,光,酶促,过氧化物酶、鲁米诺、氧化剂、增强剂等,测量方式简单（速率法）成本较低、灵敏度较高,工作曲线随时间漂移低端斜率呈非线性下移,螺旋金刚烷环氧化物、碱性磷酸酶,测量方式简单（速率法）灵敏度较高,非酶促,吖啶酯、过氧化氢,灵敏度较高,试剂成本高、发光时间短测量方式复杂（积分法）需原位进样(In Situ Injector)仪器成本及维护费用较高试剂成本较高,时间分辨荧光,铕（Eu）、镝(Dy)、钐（Sm）、铽（Tb）、等络合物脉冲光源激发,灵敏度较高、试剂较稳定,测量方式复杂（脉冲激发、间歇式测量、流动池）仪器成本及维护费用高环境及样品中同类元素可导致本底干扰,电化学发光,钌(Ru)的络合物脉冲电场激发,化学发光：Chemiluminescence,时间分辨荧光（也称时间延迟光致发光）Time Resolved Fluorescence（Time Delayed Photoluminescence）,标记物为稀土元素络合物，通常采用解离增强荧光免疫分析（DEFIA）,电化学发光（也称场致发光）Electrochemiluminescence（Electroluminescence）标记物为稀土元素络合物,商品化光生物学标记检测技术性能比较技术类型 标记、反应体系,22,例如：电化学发光TSH检测试剂的分析灵敏度为0.005mIU/L,第四代化学发光TSH检测试剂的分析灵敏度为0.001mIU/L,原因在于抗体的亲合力，而不是检测技术。,抗体筛选、干扰屏蔽，生产工艺、管理水平和技术服务是决定产品性能的关键,某些产品宣称的灵敏度远超过免疫反应的理论极限10,-19,mol/L,即：六个待测物分子/100ul样品,就发光分析而言，制约灵敏度的瓶颈在于抗体亲合力和干扰因素，而不是检测技术。,所以，片面宣扬检测技术灵敏度和线性范围的强弱，不仅毫无意义，而且也是荒谬的。,商品化发光免疫分析产品的某些宣传误区,例如：电化学发光TSH检测试剂的分析灵敏度为0.005mIU,23,C肽,胰,岛,素,免疫源性胰岛素,胰,岛,素,胰岛素原,真胰岛素,胰岛素,针对掩蔽性抗原,抗体选择胰岛素,多抗或无选择性单抗,C肽胰免疫源性胰岛素胰胰岛素原真胰岛素胰岛素针对掩蔽性抗原,24,亚,单,位,亚,单,位,亚,单,位,普通HCG,亚,单,位,HCG,亚,单,位,亚,单,位,HCG游离亚单位,亚,单,位,X,抗体选择HCG,(TSH、PRL、LH、FSH类似),多抗或无选择性单抗,针对掩蔽性抗原,亚单位特异,亚单位特异,亚单位特异,亚单位特异,普通HCGHCG HCG游离亚单位,25,结合蛋白,PSA,总PSA,PSA,游离PSA,抗体选择游离PSA,针对掩蔽性抗原,针对非掩蔽性抗原,与结合和游离PSA等分子结合,结合蛋白PSA 总PSAP,26,小分子性激素测定方法的进展,减少,结合蛋白,类似物,前体,代谢产物,干扰,直接测定法,经典方法,消化样品,萃取有机相,分子筛柱分离各类甾体,测定,血清直接测定,+,高特异性单抗,+,结合蛋白屏蔽技术,男女性激素和皮质激素均来源于共同的前体和合成、代谢途径，其结构也非常相似；而且普遍与血清中的某些蛋白结合。,因此，皮质功能紊乱、肝肾功能紊乱、某些遗传缺陷、血清蛋白异常、服用类固醇药物等均可造成这些激素测定结果的异常。,小分子性激素测定方法的进展减少直接测定法经典方法消化样品,27,游离甲状腺激素测定方法的进展,常见甲功指标：,TSH、FT,3,、FT,4,、TT,3,、TT,4,对甲亢的诊断价值依次为：,TSH=FT,3,FT,4,TT,3,TT,4,对甲低的诊断价值依次为：,FT,4,=TSHTT,4,FT,3,TT,3,但FT,3,、FT,4,灵敏度要求高，且易受干扰,发光法提高了灵敏度，使得其临床应用普遍性超过TT,4,和TT,3,两步法,操作时间长,灵敏度差,准确性差,类似物法,操作时间短,灵敏度较好,准确性较好,反向竞争法,（标记抗体）,操作时间短,灵敏度更好,准确性更好,第一代（放免）,第二代,第三代,血清FT,3,、FT,4,试剂盒的发展,（,消除结合蛋白对测定的影响,）,测定游离激素的参考方法（“金”标准）：平衡透析法（透析液过多可导致测值偏高）,