单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,ppt课件,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,ppt课件,*,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,*,第五章 亲合组织化学技术,1,ppt课件,第五章 亲合组织化学技术1ppt课件,发展历史,60,年代：发现生物素和卵白素,70,年代：植物凝集素、生物素、葡萄球菌,A,蛋白,-BRAB,、,LAB,、,SPA-HRP,、,ABC,亲和组织化学：,1976,年,Bayer,首次提出,包括植物凝集素和糖类、生物素和抗生物素、葡萄球菌,A,蛋白与,IgG,、阳离子与阴离子、激素、维生素、糖及类脂质作用部位和受体等,2,ppt课件,发展历史60年代：发现生物素和卵白素2ppt课件,植物凝集素,(Lectin),生物素,(Biotin),葡萄球菌,A,蛋白,(SPA),SPA,HRP,法、,ABC,法和,LAB,法等。,亲合组织化学技术,定义：,是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础，建立的组织细胞基础化学技术。,本质：,区别于一般的组织化学，非抗原抗体反应。,优点：,敏感性高，有利于微量抗原（或抗体）在细胞或亚细胞水平的定位。,3,ppt课件,植物凝集素(Lectin)亲合组织化学技术定义：是以一种物质,一 抗生物素,生物素免疫细胞化学技术,二 葡萄球菌蛋白,A,技术,三 凝集素组织化学技术,四 其它亲和细胞化学,4,ppt课件,一 抗生物素生物素免疫细胞化学技术4ppt课件,一、抗生物素,生物素免疫细胞化学技术,(,一,),基本原理,亲合素（抗生物素,/,卵白素）,是鸡蛋白中含有的一种碱性蛋白，属于糖蛋白,;,具有,4,个同维生素,H(,生物素,),亲合力极高的结合点。,链酶亲合素,是一种从链酶菌培养物中提取的蛋白质，和亲合素一样，也有四个生物素结合位点，是一种亲和力更高的生物素结合蛋白。,生物素（维生素,H,）,是一种小分子的水溶性维生素，它与亲合素链酶亲合素之间有很强的亲合,力，较之抗体对抗原的亲合力要高出,100,万倍，能够彼此牢固结合而不影响,彼此的生物学活性。,生物素、亲合素、链酶亲合素：,能与荧光素、铁蛋白和过氧化酶等相结合。,亲合素、链酶亲合素：,同一定浓度的生物素化酶混合后，形成亲合素一生物素一酶复合物。这种复合物可以和各种生物素标记抗体结合。,5,ppt课件,一、抗生物素生物素免疫细胞化学技术 (一)基本原理,（二）几种亲合素,生物素染色技术,1,亲合素一生物素,过氧化物酶复合物技术,(ABC),2,链酶亲合素,-,生物素,-,过氧化物酶复合物技术,(SABC,法,),3,标记生物素,抗生物素技术,(LAB),4.SP/SAP,法,5.Envision,法,6.CSA,法,6,ppt课件,（二）几种亲合素生物素染色技术 1 亲合素一生物素过氧化,ABC,复合物：,亲和素生物素过氧化物酶,复合物,1,亲合素一生物素,过氧化物酶复合物技术,(ABC),7,ppt课件,ABC复合物：1 亲合素一生物素过氧化物酶复合物技术(AB,基本原理,是将亲合素作为“桥”与生物素化的抗体与生物素结合的酶（,HRP),连接起来。,第一抗体：,为未标记特异性抗体，能结合组织中待测抗原；,第二抗体：,为,生物素化的桥抗体,，能与第一抗体结合；,第三抗体：,是结合了过氧化物酶的亲合素复合物,(,即,ABC,),。,优点：,敏感性强（比,PAP,高,20-40,倍）；,特异性强，背景染色淡；,方法简便，节约时间,（比,PAP,缩短,2h,）,；,由于生物素与抗生物素具有和多种示踪物结合的能力，可用于双重或多重免疫染色。,8,ppt课件,优点：8ppt课件,操作步骤,冰冻切片或石蜡切片均可。,冰冻切片：丙酮固定，,PBS,洗,5min,，更换,3,次。,石蜡切片：脱蜡，系列酒精至水。,第一抗体,孵育，过夜。,PBS,洗,5min,，更换,3,次。,加,生物素标记的第二抗体,，孵育,15min,。,PBS,洗,5min,，更换,3,次。,加,ABC,复合物,室温作用,15min,。,PBS,洗,5min,，更换,3,次。,用,DAB,显色。,复染、封片、观察。,结果,呈棕黄色为阳性表达，核被苏木精染成浅蓝色。,9,ppt课件,操作步骤 PBS洗5min，更换3次。结果 9p,(4),注意事项,消除内源性生物素：,染色前以,0.01,的亲合素和,0.01,生物素溶液分别作用,20min,以消除内源性生物素活性，每次作用后用,PBS,漂洗,3,次，,5min,。,消除内源性过氧化物酶：,可用,3,H,2,O,2,孵育,5-10,分钟以灭活内源性过氧化物酶活性。蒸馏水洗,3,次。,试剂的保存：,温度以,4,为佳，可达,2,年之久，在,20,时其生物活性反而在短期内被破坏。,此外，生物素制剂之间相互亲和性差异大，注意厂家和批号。,10,ppt课件,(4)注意事项 消除内源性生物素：染色前以0.01的亲,SABC,法,原理：,一抗生物素化二抗,SABC,复合物,SABC,复合物,链霉卵白素生物素过氧化物酶,生物素标记的二抗,链霉卵白素连接,生物素标记的酶。,优点：,敏感性略高于,SP,法，低背景和操作简便,缺点：,因体内含有内源性生物素，易产生非特异性染色。,一抗,+,生物素标记二抗,+,滴加试剂,SABC,（链霉卵白素,+,辣根酶标记生物素,)+,辣根酶底物显色,2,链酶亲合素,-,生物素,-,过氧化物酶复合物技术,(SABC,法,),11,ppt课件,SABC法原理：一抗+生物素标记二抗+滴加试剂SABC（链霉,SABC,试剂盒,(,含正常血清，生物素化二抗，,SABC,等,),操作程序,1,）载玻片防脱处理：可选择,APES,或,Poly,Lysine,，烤片。,2,）切片常规脱蜡至水。,3,）,3,H,2,0,2,灭活内源性酶。蒸馏水洗,3,次。,4,）抗原热修复：将切片浸入枸橼酸盐缓冲液,(PH6.0),，电炉或微波炉加热至沸腾后断电，间隔,5,10,分钟后，反复,1,2,次。冷却后,PBS,洗涤。,5,）滴加,5,BSA,封闭液，室温,20,分钟。甩去多余液体，不洗。,6,）滴加适当稀释的,一抗,，,371,小时左右或,202,小时左右。,也可,4,过夜。,PBS(pH7.2,7.6),洗,2,分钟,3,次。,对照切片用,PBS,代替一抗。,12,ppt课件,SABC试剂盒(含正常血清，生物素化二抗，SABC等)操作程,7,）滴加,生物素化二抗,，,20,3720,分钟。,PBS(pH7.2,7.6),洗,2,分钟,3,次。,8,）滴加试剂,SABC,，,20,3720,分钟。,PBS(pH7.2,7.6),洗,5,分钟,4,次。,9,）,DAB,显色：使用,DAB,显色试剂盒。取,1ml,蒸馏水，加试剂盒中,A,、,B,、,C,试剂各,1,滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，一般在,5,一,30,分钟之间。蒸馏水洗涤。,10,）苏木素轻度复染。脱水，透明，封片。显微镜观察。,结果,棕褐色为阳性结果，而细胞核染为淡蓝色。,13,ppt课件,13ppt课件,注意事项,1,）染色背景过高：,在,SABC,反应之后，,DAB,显色之前，用加有,0.0l,一,0.02,TWEEN20,的,PBS(pH7.2,7.6),洗涤切片,4,次，单纯,PBS,洗,2,次，然后,DAB,显色。,2,）抗原热修复：,可选,0.01M,枸橼酸盐缓冲液；,也可以使用,PBS,、,TBS,等多种缓冲液。,14,ppt课件,注意事项 14ppt课件,3,标记生物素,抗生物素技术,(LAB),原理：,第,抗体：,生物素标记；,第二抗体：,酶标记抗生物素,(,亲合素,),操作步骤：,切片中加入,生物素标记一抗,，室温孵育,1 h,，。,0.01MPBS,洗,3,次，每次,5 min,。,20-50ug,ml,HRP-,抗生物素,液孵育。,0.01M PBS,漂洗,3,次。,DAB,显色。蒸馏水漂洗。,苏木精复染核。梯度乙醇脱水、透明、封片、镜检。,应用不如,ABC,普遍，但手续较简便，但灵敏度低。,15,ppt课件,3 标记生物素抗生物素技术(LAB)原理：15ppt课件,SP,法（过氧化物酶标记的链霉卵白素,/,过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染色）,原理：,一抗生物素化二抗酶标记的链霉卵白素,优点：,高灵敏度、低背景、操作方便,缺点：,不适用于内源性生物素丰富的组织,16,ppt课件,SP法（过氧化物酶标记的链霉卵白素/过氧化物酶标记的碱性磷酸,三步法（以,SP,试剂盒为例）,石蜡切片脱蜡至水。,蒸馏水冲洗，,PBS,浸泡,5,分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。,3%H,2,O,2,室温孵育,5-10,分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，,PBS,冲洗，,2,分钟,3,次。,5-10%,正常山羊血清封闭，室温孵育,10,分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的,一抗,或一抗工作液，,37,孵育,1-2,小时或,4,过夜。,PBS,冲洗，,2,分钟,3,次。,滴加适当比例稀释的,生物素标记二抗,（,1%BSA-PBS,稀释），,37,孵育,10-30,分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，,37,或室温孵育,10-20,分钟。,PBS,冲洗，,2,分钟,3,次。,滴加适当比例稀释的,辣根酶标记链霉卵白素,（,PBS,稀释），,37,孵育,10-30,分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，,37,或室温孵育,10-20,分钟。,PBS,冲洗，,2,分钟,3,次。,显色剂显色（,DAB,或,AEC,）。,自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。,17,ppt课件,三步法（以SP试剂盒为例）石蜡切片脱蜡至水。,原理：,将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体,优点：,1,简便、快速、敏感性是,SP,、,SABC,法的几十倍。,2,人体组织中不含有这种多聚物，从而避免了组织中生物素的干扰,缺点：,因大分子穿透核膜困难,对于核内抗原的定位不能选用此法。,Envision,法,一抗,+,二抗标记多聚螯合物酶,Envision,法,18,ppt课件,原理：Envision法Envision法18ppt课件,EnVision,工作程序：,1,）脱蜡、水化组织切片。,2,）预处理组织切片（据一抗具体说明而定）,3,）蒸馏水漂洗，置于,PBS,中。,4,）阻断内源性过氧化物酶（仅用于,EnVisionTM/HRP,）,5,）蒸馏水漂洗，置于,PBS,，,10,分钟,6,）,一抗,孵育,10-30,分钟,7,）,PBS,漂洗,10,分钟,8,）,EnVision,TM,孵育,10-30,分钟,9,）,PBS,漂洗,10,分钟,10),色源底物溶液孵育,10,分钟,11),蒸馏水漂洗,12),复染及封片,19,ppt课件,EnVision工作程序：1）脱蜡、水化组织切片。2）,CSA,法（催化信号放大法）,原理：,是酪胺的过氧化物酶反应,(,即,HRP,催化酪胺盐，形成共价键结合位点,),，产生大量的酶促产物，该产物能与周围的蛋白残基,(,包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基,),结合，这样在抗原,抗体结合部位就有大量的生物素沉积，与随后加入的链霉亲和素,HRP,结合，如经几次这样的循环放大，可以网络许许多多的酶分子，最后通过,DAB,的显色反应，其敏感性得到几何级放大。,优点：,比,EnVision,法敏感,20,100,倍。,适合于实验病理学和第一抗体昂贵、抗原性较弱的,IHC,检测以及抗原破坏严重、抗原量较少的组织细胞抗原的检测方法,;,核内抗原的检测（原为杂交）。,缺点：,操作步骤多、孵育时间长，存在严重的内源性干扰，背景染色有时较重。,20,ppt课件,CSA法（催化信号放大法）原理：20ppt课件,二、葡萄球菌蛋白