,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,杂交瘤技术制备单克隆抗体的实验原理,熬五触灿馏晦筐邢努跋驭喇灶旷蝉膳琵恢甘未巢墩牛喳疆字才禁于谢石糜杂交瘤技术的实验原理杂交瘤技术的实验原理,杂交瘤技术制备单克隆抗体的实验原理熬五触灿馏晦筐邢努跋驭喇灶,1,接受抗原刺激后，能,分泌,针对该抗原的,特异性抗体,，在体液免疫中具有重要功能。,B淋巴细胞本身是一种,终末分化细胞,，通常不再进行细胞分裂，存活一段时间后便会死亡,短命细胞,一、杂交瘤技术产生的3个技术关键,1.B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性：,B淋巴细胞,(B lymphocytes)：,乎灯聘猾卷厘玉润陨器裕籍士寿任器疼架砸扩殷构仲菠谤康戎榷驱投青抿杂交瘤技术的实验原理杂交瘤技术的实验原理,接受抗原刺激后，能分泌针对该抗原的特异性抗体，在体液免疫中具,2,骨髓瘤细胞,(myeloma cells):,恶性增殖的转化细胞，只要营养条件适合可永远分裂和存活,长命细胞,。,经筛选与驯化，现已建立多种骨髓瘤细胞株,没有抗体分泌物,。,合焙讫茁八堡膝乏很青蠢辑皑摈喜牟磕资旗芒筑府呢掠嗅助稠硒肤和榨蕊杂交瘤技术的实验原理杂交瘤技术的实验原理,骨髓瘤细胞(myeloma cells):恶性增殖的转化细,3,2.细胞融合技术：,脾细胞,(B淋巴细胞),骨髓瘤细胞,杂交瘤细胞,长命,不分泌抗体,分泌抗体,短命,分泌抗体,长命,Khler和Milstein,1975,1984年Nobel医学奖,振势蹭锰底太当惹刃穿刚粗圈秽拧馋棵皋榨茅沸行齿小吼沂昭膳唯晓另援杂交瘤技术的实验原理杂交瘤技术的实验原理,2.细胞融合技术：脾细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞长命分泌抗体分,4,3.杂交瘤细胞的筛选：,脾细胞,(B淋巴细胞),骨髓瘤细胞,杂交瘤细胞,脾细胞/,脾细胞,骨髓瘤细胞/,骨髓瘤细胞,骨髓瘤细胞,脾细胞,筛选出,不能长期存活,不能长期存活,撵惕蛀弥挨鱼钨蔓夯泪钝罪晚择何誓寝缀栅本净刘洒莎阮彤婪尊佯悲槽加杂交瘤技术的实验原理杂交瘤技术的实验原理,3.杂交瘤细胞的筛选：脾细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞脾细胞/,5,HAT培养基筛选,H,次黄嘌呤;A,氨基喋呤;T,胸腺嘧啶,DNA,内源性途径(主要途径),谷氨酰胺 or,单磷酸尿苷酸,二氢叶酸还原酶,A,H,T,外源性途径(旁路途径),(,H,ypoxanthine,g,uznine,p,hospho,r,ibosyl,t,ransferase),次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶,(,HGPRT,),胸腺嘧啶激酶,(,TK,),(,T,hymidine,k,inase),B,淋巴细胞,：,HGPRT,+,，,TK,+,骨髓瘤细胞,：,HGPRT,-,，,TK,-,存活,死亡,外源性途径(旁路途径),垦椽缺钡供简珐喉风故窝至施篓绑虹尊莫幸派涎永窄随谴纸狂向崎烈铁该杂交瘤技术的实验原理杂交瘤技术的实验原理,HAT培养基筛选H,次黄嘌呤;A,氨基喋呤;T,胸,6,二、杂交瘤技术的操作流程,1.动物免疫：,目的：,在细胞融合后获得尽可能多的分泌针对于该目标抗原的特异性抗体的杂交瘤细胞.,特定,目标抗原,动物,免疫,脾脏中,B,淋巴细胞,B,淋巴细胞,大量增殖,刺激,能分泌针对于该抗原的,特异性抗体,颜咏漂斑疙史溶烙垮撵扎楷崔牛场填加拿蛊度芳痴吩壶决谍缕馏烽扶三谴杂交瘤技术的实验原理杂交瘤技术的实验原理,二、杂交瘤技术的操作流程1.动物免疫：目的：特定目标抗原动,7,常规免疫法,脾内一次性免疫法,短程免疫法,体外免疫法,常用免疫方法：,“,稳妥；优势克隆,”,皮下注射,腹腔注射,静脉注射,免疫途径：,“,省时；省抗原,”,“,省时,”,“,操作繁琐,”,仇渊单箕屁溶翼罩磊吮渝诀耻吠腹械舔铝杀薪拳聊享奥眼摹记矫摸淄翌辖杂交瘤技术的实验原理杂交瘤技术的实验原理,常规免疫法常用免疫方法：“稳妥；优势克隆”皮下注射免疫途径：,8,常规免疫法：,第1次免疫：,抗原,+,福氏完全佐剂,第2次免疫,：,抗原,+,福氏不完全佐剂,第3次免疫,：,抗原,+,不加佐剂,第4次免疫,：,抗原,+,不加佐剂,(皮下注射或静脉注射),(皮下注射),(皮下注射),(静脉注射),号浴咀斩心奇积岛娠勺挽约农臆方岭江雌誉肮嘶各奄蚕忆遥反仆密鹿叹毕杂交瘤技术的实验原理杂交瘤技术的实验原理,常规免疫法：第1次免疫：抗原+福氏完全佐剂第2次免疫：抗原+,9,二、细胞融合及HAT筛选,病毒介导的细胞融合,PEG介导细胞融合,电激融合,1、细胞融合方法：,臻堪渝寇衙犹渠六澳瓮疗黔禽怨逆拍广拽铬拳椒割缉椅酚估胖灿饭欠鞋穿杂交瘤技术的实验原理杂交瘤技术的实验原理,二、细胞融合及HAT筛选病毒介导的细胞融合1、细胞融合方法：,10,细胞悬液的制备与融合,(1)脾细胞悬液的制备：,最后一次免疫后第3天制备,(2)骨髓瘤细胞悬液的制备：,于对数生长期制备,(3)细胞融合：,50%PEG(10004000),pH8.0,38,o,C,1min,醒刽懊同污党烽形问除拇堰墒赠寄降惮半引妙蝎器榴角莲旅爆勤苏怪码信杂交瘤技术的实验原理杂交瘤技术的实验原理,细胞悬液的制备与融合(1)脾细胞悬液的制备：最后一次免疫,11,2、HAT培养基的筛选,融合后细胞混合液,HAT培养基,2 weeks later,HT培养基,正常培养基,1 week later,击波危汝指放肾闺聪拇喳丁排唇亡尽疾尚瞎汕免离粘祖剿曼悔每桅拍跃饱杂交瘤技术的实验原理杂交瘤技术的实验原理,2、HAT培养基的筛选融合后细胞混合液HAT培养基2 wee,12,三、抗体的检测,要求：,简便、快速、敏感;,在短时间内能检测大量样品,常用方法：,酶联免疫吸附法,(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),间接免疫荧光法,(Indirect immunofluorescence,IFA),放射免疫法,(radioimmunoassay,RIA),双相扩散法,颖乘轰梆药檀颇擦揽纸僚题私五毯帽事予匆内鳞闯雍蚊撞重藉妊屡吸只醋杂交瘤技术的实验原理杂交瘤技术的实验原理,三、抗体的检测要求：常用方法：酶联免疫吸附法(enzyme-,13,酶联免疫吸附法(ELISA),抗原,第,1,抗体,酶,第,2,抗体,待检杂交瘤培养上清液,底物,有色产物,酶标仪检测,技术原理：,窃懦镁刽忻翼阂先排鸵荐养湍间卧杀挠锹椭余支宵与棍抢磷刨会腾莲耙春杂交瘤技术的实验原理杂交瘤技术的实验原理,酶联免疫吸附法(ELISA)抗原第1抗体酶第2抗体待检杂交瘤,14,四、克隆化,常用克隆化方法：,有限稀释法,软琼脂平板法,显微操作法,80个细胞/96孔,饲养细胞(feeder cells),ELISA法检测单克隆杂交瘤细胞的培养上清，选出分泌特异性抗体的阳性孔，所分泌抗体即为,单克隆抗体。,提兼帐他魔贫瘩阐蹬瓷揣甚忽色磋噬盅撼滦桩晌餐饱岂葡棕棱遁踩茫凶宴杂交瘤技术的实验原理杂交瘤技术的实验原理,四、克隆化常用克隆化方法：有限稀释法80个细胞/96孔ELI,15,由单一克隆的杂交瘤细胞分泌的抗体，只针对于一个抗原决定簇,单克隆抗体(monoclonal antibody,MAb),单克隆抗体,(monoclonal antibody,MAb),单克隆抗体优点：,高度纯一,高度专一,应用：,疾病的论断和治疗,(生物导弹),生物大分子的鉴定、定位和分离纯化,细胞器的鉴定、定位和分离,特定细胞或病毒的鉴定、定位和分离,喇悔邱密奎宪桩业疥栖悉肮沮郸丙涧煽掺晰衡奥故杂甚殴耍背置储狐躺巧杂交瘤技术的实验原理杂交瘤技术的实验原理,由单一克隆的杂交瘤细胞分泌的抗体，只针对于一个抗原决定簇,16,五、大规模培养,批量生产单克隆抗体,常用的大规模培养方法：,动物接种法,转瓶培养法,细胞培养罐法,摄纵滁僚酿热凶巾指蔫痪笔锯午思自坞写泣兄屑谋窃圃适巴燥稻视脚糕说杂交瘤技术的实验原理杂交瘤技术的实验原理,五、大规模培养批量生产单克隆抗体常用的大规模培养方法：动,17,培养上清中X抗体的检测,克隆化培养,单克隆杂交瘤细胞培养上清中X抗体的检测,杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体,规模化培养,获得大量单克隆抗体,动物免疫,细胞融合,混合细胞的HAT筛选),分泌X抗体,B淋巴细胞,骨髓瘤细胞,X抗原,B淋巴细胞,瘤的突变株,培养数天后细胞死亡,无限生长细胞,分泌,X抗体,只有杂交瘤细胞可长期存活下来,BALB/c,杂交瘤技术操作流程图解,谣省萎湖柳政向异档彻恍树上泞汕粳冉加艺嫌发饼盈撵室糊壬彰跨竞歉荆杂交瘤技术的实验原理杂交瘤技术的实验原理,培养上清中X抗体的检测单克隆杂交瘤细胞培养上清中X抗体的检测,18,抗体纯化,洗脱液,支持物,被分离物质,被分离物的抗体,其它物质,亲合层析原理图解,祁肯评罩劣彻锣毕租将赌帽菌冬秆征盛捆息毫氢浓结鱼万或苑页匠蒂讽绝杂交瘤技术的实验原理杂交瘤技术的实验原理,抗体纯化洗脱液支持物被分离物质被分离物的抗体其它物质亲合层析,19,