单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第十四章 免疫细胞的分离及其表面标志检测技术,第一节 免疫细胞的分离,一、外周血单个核细胞分离,二、淋巴细胞的分离,三、T细胞和B细胞的分离,四、T细胞亚群的分离,第十四章 免疫细胞的分离及其表面标志检测技术第一节,1,第二节 淋巴细胞标志及亚群分类,一、细胞表面标志及亚群,二、B细胞表面标志,三、NK细胞表面标志,第三节 其他的免疫细胞,第四节 免疫细胞表面标志的检测及应用,一、免疫细胞表面标志的检测方法,二、淋巴细胞表面标志检测的临床意义,思考题,小结,第二节 淋巴细胞标志及亚群分类思考题,2,第十四章免疫细胞的分离及其表面标志检测技术课件,3,第一节 免疫细胞的分离,外周血单个核细胞分离,淋巴细胞的分离,T细胞和B细胞的分离,T细胞亚群的分离,第一节 免疫细胞的分离 外周血单个核细胞分离,4,一、外周血单个核细胞分离,外周血单个核细胞,（peripheral mononuclear cells,PMNC）,包括淋巴细胞和单核细胞（monocyte）。,Ficoll,分离液法主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。,一、外周血单个核细胞分离 外周血单个核细胞（peripher,5,细胞分离基本原理,不同细胞密度不同,不同细胞表面生物学特性不同,不同细胞表面分化抗原不同,细胞分离基本原理不同细胞密度不同,6,不同细胞密度不同,人的红细胞密度为,1.093,粒细胞密度为,1.092,单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为,1.075-1.090,不同细胞密度不同人的红细胞密度为1.093,7,不同细胞密度不同,不同细胞密度不同,8,用1.0770.001的分层液可将细胞分离,用1.0770.001的分层液可将细胞分离,9,密度梯度离心(Ficoll)离心,密度梯度离心(Ficoll)离心,10,二、淋巴细胞分离,贴壁粘附法,吸附柱过滤法,磁铁吸引法,Percoll 分离液法,（连续密度梯度离心）,（去单核细胞）,二、淋巴细胞分离贴壁粘附法（去单核细胞）,11,E花环沉降法,尼龙毛柱分离法,三、T细胞和B细胞的分离,E花环沉降法 三、T细胞和B细胞的分离,12,四、T细胞亚群的分离,亲和板结合分离法,磁性微球分离法,荧光激活细胞分离仪分离法,四、T细胞亚群的分离 亲和板结合分离法,13,荧光激活细胞分离仪分离法,荧光激活细胞分离仪分离法,14,第十四章免疫细胞的分离及其表面标志检测技术课件,15,磁珠大小可以选择,磁珠大小可以选择,16,大小免疫磁珠分离细胞的特点比较,比较项目,大磁珠,小磁珠,对细胞的影响,对细胞造成机械压力，影响其生物学活性，不利于分离后培养。,对细胞温和，不影响分离细胞的后续培养。,对流式细胞仪的影响,阻塞流式细胞仪的喷嘴，影响散射光。,可直接上流式细胞仪检测，不影响散射光。,分离条件要求,技术简单，分离可在试管中完成。,需要很强的磁场来分离细胞。,收率,得率高。,得率不高。,纯度,纯度低。,纯度高。,分离时间,分离速度快。,分离速度慢。,分离成本,成本低。,需要很强的磁场来分离细胞，需要一次性的分离柱，不能在普通试管进行。,大小免疫磁珠分离细胞的特点比较 比较项目大磁珠小磁珠对细胞的,17,18,第十四章免疫细胞的分离及其表面标志检测技术课件,19,免疫磁珠法细胞分选过程,免疫磁珠法细胞分选过程,20,免,疫,磁,珠,细,胞,分,选,装,置,免,21,全自动细胞分选系统,全自动细胞分选系统,22,流式细胞分析仪,流式细胞分析仪,23,第二节 淋巴细胞标志及亚群分类,常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志是簇分化抗原（Cluster of differentiation，CD）。,第二节 淋巴细胞标志及亚群分类 常用于鉴定和检测淋巴细胞,24,细胞表面分化抗原（CD抗原,）,适用于T、B细胞的分离,已知CD抗原细胞亚群的分离,未知CD抗原细胞亚群的分离,（阴性分选）,细胞表面分化抗原（CD抗原）适用于T、B细胞的分离,25,一、T细胞表面标志及其亚群,CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞,（help T cell,Th）,CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞,（cytotoxic T cell,Tc or CTL）,CD4+CD25+调节性T细胞,（regulatory T cell,Tr or Treg）,一、T细胞表面标志及其亚群 CD3+CD4+CD8-辅助性T,26,二、B细胞表面标志,SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，部分CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。,CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的B细胞,。,二、B细胞表面标志 SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受,27,三、NK细胞表面标志,人类NK细胞表面标志主要以CD16、CD56来认定，临床上将CD3-CD56+CD16+淋巴细胞认定为NK细胞。,三、NK细胞表面标志 人类NK细胞表面标志主要以,28,T细胞及NK细胞,T细胞及NK细胞,29,第三节 其他的免疫细胞,抗原提呈类细胞表面标志,第三节 其他的免疫细胞抗原提呈类细胞表面标志,30,第四节 免疫细胞表面标志的检测及应用,免疫细胞表面标志的检测方法,淋巴细胞表面标志检测的临床意义,第四节 免疫细胞表面标志的检测及应用免疫细胞表面标志的检测方,31,一、免疫细胞表面标志的检测,抗体致敏细胞花环法,免疫细胞化学法,免疫荧光法,流式细胞分析法,一、免疫细胞表面标志的检测抗体致敏细胞花环法,32,二、淋巴细胞表面标志检测的临床意义,淋巴细胞表面标志检测是评价免疫功能的重要指标。,对CD4+和CD8+T细胞的测定，有助于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反应的监测。,二、淋巴细胞表面标志检测的临床意义 淋巴细胞表面标志检测是评,33,临床常见疾病中的,T,淋巴细胞的变化,临床常见疾病中的T 淋巴细胞的变化,34,思考题,1.免疫细胞都包括哪些细胞？为什么要将其分离纯化？,2.淋巴细胞有哪几类细胞？能用形态学的方法加以区别吗？,3.将细胞分离的原理有哪些？各有什么特点？,4.形态学相同的一类细胞为什么还要分亚群？,5.T细胞和B细胞进一步区分亚群的依据是什么？,思考题1.免疫细胞都包括哪些细胞？为什么要将其分离纯化？,35,6.什么是细胞表面标志？其作用是什么？,7.细胞表面标志的检测方法有哪些？,8.利用细胞表面标志（CD抗原）分离细胞的方法有哪几种？,9.T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞的主要生物标志是什么？,10.淋巴细胞表面标志检测的临床意义是什么？,6.什么是细胞表面标志？其作用是什么？,36,小 结,淋巴细胞并不是功能单一的群体，但其在光学显微镜下的形态基本是一样的，因此要对其进行进一步的分类和观察就不能采用形态学的方法，而要依靠对其表面标志的检测。常用于鉴定和检测计数淋巴细胞的表面标志是CD抗原。,小 结淋巴细胞并不是功能单一的群体，但其在光学显微镜下的形,37,进一步区分淋巴细胞亚群可使某一类淋巴细胞的功能趋向一致和单一。但目前看来，还很少有只通过一个CD抗原就能将某一类淋巴细胞亚群指示出来的CD抗原，CD抗原指示出来的淋巴细胞亚群多数都是相对特异。,进一步区分淋巴细胞亚群可使某一类淋巴细胞的功能趋向一致和单一,38,根据T细胞的免疫效应功能和表面CD分子表达至少可以分为：辅助性T细胞、细胞毒性T细胞和调节性T细胞；SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标，以CD5和CD19为标志可将B细胞分为B1和B2两个亚群；目前多以CD3-、CD16+、CD56+作为NK细胞的典型标志。,根据T细胞的免疫效应功能和表面CD分子表达至少可以分为：辅助,39,